――生物化学实验
一、目的
了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二、原理
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应(蛋白质分子中有-CS-NH2, -CH2-NH2, -CHNH2CH2OH等基团，这些基团亦可与碱性高价铜呈颜反应)，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫配合物，在540m处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜深浅成正比，可用比法定量测定。 双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈反应，但Cu2＋离子容易被还原，有时会出现红沉淀。
三、实验仪器
1．容量瓶10ml(×6)。
2．试管1.5cm×15cm(×8)。
3．吸管5.0ml(×3)、2.0ml(×1)。
4．722型(或7220型)分光光度计。
颈部肿块的鉴别诊断 四、实验试剂
1、双缩脲试剂：将0.175g CuSO4·5H20溶于约15ml蒸馏水，置于l00ml容量瓶中，加入30ml浓氨水30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2h，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
2、卵清蛋白液：约lg卵清蛋白溶于l00ml 0.9％NaCl溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据测定结果，用0.9％NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为2rng/ml。亦可用2mg/ml的牛血清白蛋白溶液。
3、未知液：可用酪蛋白配制。
五、操作
1、标准曲线的绘制：将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。
表 双缩脲法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制
瓶号 | 2mg/ml卵清蛋白液体积ml | 蒸馏水 | 蛋白质浓度(mg/ml) |
刘向1 | 1.0 | 稀释至刻度 | 0.2 |
2 | 2.0 | 稀释至刻度 | 0.4 |
3 | 3.0 | 稀释至刻度 | 李俊虎 0.6 |
4 | 4.0 | 稀释至刻度 | 0.8 |
5 | 5.0 | 稀释至刻度 | 1.0 |
拉格朗日6 | 6.0 | 稀释至刻度 | 1.2 |
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取干净试管7支，按0、1、2、3、4、5、6编号，1～6号管分别加人上述不同浓度的蛋白质溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加人双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即
客户经理制有紫红出现，用540nm光测定各管吸光度(须在显后30min内比，30min后可能有雾状沉淀产生；各管由显到比的时间尽可能一致)。绘制浓度一吸光度曲线。
2、样液测定：
取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml(样品液浓度控制在0.05-1.25mg/ml范围内)置试管内，加入双缩脲试剂2．0ml，混匀，测其540hm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。
六、思考题
华南城刘晓东1、写出双缩脲反应的方程式。
2、简述用分光光度法测定蛋白质浓度的原理。
3、总结本实验应该注意的主要问题。
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