蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford）。其中Bradford 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。这4种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间。1 凯氏定氮法1. 1 原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。1. 2 特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和 最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素肌球蛋白,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。
凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。
2 双缩脲法(Biuret )
2. 1 什叶派原理
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫络合物颜的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。
2. 2 特点
松崖别业图卷 双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响, 采用0.5 g 样品,40 mL 双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜的深浅相近,不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一,方法简便，但灵敏度差，测定范围为1印度支那问题～20 mg 蛋白质。适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。
3 紫外吸收法
3. 1 原理
蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280 nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238 nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
3. 2 特点
最常用的紫外吸收法是280 nm 的光吸收法，含有核酸的蛋白质溶液使用280 和260 nm 的吸收差法较好。蛋白质的稀溶液采用215 与225 nm 的吸收差法。紫外吸收法简便、灵敏
、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。
缺点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。此外,进行紫外吸收法测定时, 由于蛋白质吸收高峰常因pH 的改变而有变化,因此要注意溶液的pH 值,测定样品时的pH 要与测定标准曲线的pH 相一致。
4 考马斯亮蓝法( Bradford)
4. 1 原理
Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝，其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm, 蛋白质在1～1 000 μg 范围内, 蛋白质－素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质
的定量测定。
4. 2 特点
考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合反应十分迅速而稳定,2 min 左右即达到平衡,其结合物室温下1 h内保持稳定，且在马克思进文庙5～20 min 之间,颜的稳定性最好。该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显剂易于配制。干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此
Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ- 球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer 定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。
Folin—酚试剂法（Lowry法）
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显反应产生深兰的原因是：?在碱性条件下，
蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰深度与蛋白的量成正比。
补充
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显测定。若样品酸度较高，显后会浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中
时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
使用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。
蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍
【GB/T 5009.5—1985】
食品中蛋白质的测定方法
本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。
1 原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。
3 仪器
4 操作方法
4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的 100ml或中国成第二投资国500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理
样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰或蓝紫为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作。
4.4 计算
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
式中：X——样品中蛋白质的含量，%；
V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m——样品的质量(体积)，g(ml)；
F——氮换算为蛋白质的系数。
蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质。
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