摘要：牛奶中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L，等电点为4.7。将牛奶的pH调制4.7时可是酪蛋白沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物除去脂类物质后可得纯的酪蛋白。提取出的酪蛋白与双缩脲可发生反应，与茚三酮反应生成蓝紫物质，与浓硝酸反应可发生黄反应。该化合物在碱性溶液中进一步形成深黄的硝醌酸钠。 关键字：酪蛋白 等电点 沉淀 离心 双缩脲反应 卵清蛋白 茚三酮反应 黄反应 沸水浴
牛奶是一种营养价值很高的食品，主要由水、脂肪、蛋白质、乳糖和盐组成。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，含量约为2．6 g／100 mL，占牛奶中蛋白质总量的80％ 。酪蛋白含有人需的8种氨基酸，极易消化吸收，是优质氨基酸供给源。牛奶中的B～酪蛋白，具有较强的抗变异原机制，能减少癌变。同时牛奶中含有许多人体所需的矿物质及维生素。做为牛奶的主要成分酪蛋白，在饮用时能促进心血管的健康，控制高血压，增强免疫机能，改善睡眠状况。并且由于酪蛋白与乳糖在食品加工、医药等领域具有广泛的用途，所以对分离方法的研究具有重要的经济效益和社会效益。通过此次实验，我们将学习制备酪蛋白的方法以及用显反应对酪蛋白进行定性分析的方法。
1 材料与方法
1.1 效益费用比材料：市售袋装古城牌牛奶
1.2 酪蛋白的制备：
将40mL牛奶放在烧杯中，在水浴锅中加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液80mL。用精密pH试纸或酸度计调节其pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000r/min），弃去上清夜，得酪蛋白粗制品。
用蒸馏水洗沉淀3次，每次离心10分钟（3000r/min），每次弃去上清液，加30ml水拌均匀配平。在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌，可除去脂类杂质。将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次，直至沉淀变为白粉末状，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得到酪蛋白纯品。准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100mL 牛乳（g%）
得率：测得含量/理论含量X100%
1.3 双缩脲反应
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡均匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜。
量取1mL酪蛋白溶液放入试管A中，先取双缩脲试剂10％NaOH 2mL加入试管中，摇荡
均匀（必须营造碱性环境），再加入双缩脲试剂1%CuSO4溶液 2滴，边加边摇。观察试管中
溶液颜的变化。
量取1mL卵清蛋白溶液放入另外一支试管B中，先取双缩脲试剂10％NaOH 2mL加入试
管中，摇荡均匀（必须营造碱性环境），再加入双缩脲试剂CuSO4 2滴，边加边摇。观察试
管中溶液颜的变化。
1.4茚三酮反应
量取1mL酪蛋白溶液于试管1中，然后加入0.5 mL 0.1％茚三酮溶液，沸水浴加热。
量取1mL卵清蛋白溶液于试管2中，然后加入0.5 mL 0.1％茚三酮溶液，沸水浴加热。
量取1mL甘氨酸溶液于试管3中，然后加入0.5 mL 0.1％茚三酮溶液，沸水浴加热。
对比观察三个反应的颜变化，做记录并对结果进行分析。
1.5黄反应
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
材料 | 鸡蛋清溶液 | 指甲 | 头发 | 0.3氨酸 | 酪蛋白溶液 |
用量（滴） | 4 | 少许 | 少许 | 4 | 4 |
浓硝酸（滴） 惠普nc4400 | 十七大报告2 | 40 | 40 | 4 | 4 |
| | | | | |
对比观察四个试管中各自溶液颜的变化，做记录并对结果进行分析。
2.实验结果与分析
2.1酪蛋白的制备
含量：3.13g/100mL牛乳
得率：89.4%
牛奶中酪蛋白的含量大于80%属合格产品，若大于90%，则属优质产品。该牛奶含量为89.4%，为合格牛奶，可放心饮用。
2.2双缩脲反应
酪蛋白经双缩脲反应后，生成紫物质。
卵清蛋白经双缩脲反应后，生成紫物质。
双缩脲反应是指具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生成紫的络合物，是肽和蛋白质所特有的性质。双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫的络合物。因为蛋白
质中含有很多与双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）结构相似的肽键，故也能与铜离子发生双缩脲反应，形成紫复合物，颜深浅与蛋白质浓度成正比。
双缩脲试剂与多肽形成的配合物沈那遗址
2.3茚三酮反应
酪蛋白与茚三酮沸水浴中反应后，颜为浅蓝。
卵清蛋白溶液中加入0.1％茚三酮溶液，未加热前，溶液变浑浊，沸水浴加热后，颜为淡蓝。
甘氨酸溶液中加入0.1％茚三酮溶液，未加热前，溶液为蓝紫，沸水浴加热后，颜为深紫。
在加热条件下，氨基酸或肽可与茚三酮反应生成紫（与脯氨酸反应生成黄）的化合物。氨基酸与茚三酮的反应是氨基酸的α-NH2所引起的反应，α-氨基酸与水合茚三酮一起在水溶液中加热，可发生反应生成紫物质。由于蛋白质是由许多α－氨基酸组成的，所以也呈此颜反应。茚三酮反应的方程式为：
2.4黄反应
1号试管反应后颜为浅黄
2号试管反应后颜为亮黄
3号试管反应后颜为亮黄
4号试管反应后颜为浅黄
5号试管反应后颜为浅黄
此反应叫黄蛋白反应，也称蛋白黄反应，是带有苯环的蛋白质与浓硝酸混
合加热后呈现黄的反应。由于一些氨基酸含有苯环，如酪氨酸、氨酸等，在
加入硝酸后硝酸对苯环发生硝化作用，生成黄的芳香硝基化合物，使蛋白质发
生变性。黄蛋白反应的方程式为
3．讨论
虽然在本实验室提取的酪蛋白比理论含量要少，检测的几项结果也有差异，但通过进一步的细化实验过程，使现有条件下提取的酪蛋白各成分更加接近标准酪蛋白试剂，来代替标准酪蛋白试剂的使用。
通过实验了解了构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄物质外，所有的α氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫物质。
另外，这次实验后，我们学会了使用离心机，掌握了制备酪蛋白的方法，明白了蛋白质的
特性反应，并由所得结果可知：古城牛奶中的酪蛋白符合蛋白质的特性反应。通过求得其得率可知该牛奶属合格产品可放心饮用。
4.参考文献
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