这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。 （1）简易经验公式
蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
（2）精确计算
通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D黑泽明的电影风格
其中d为测定OD值比杯的厚度
主治医师D为溶液的稀释倍数
二、比法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显基团或者染料反应，产生有物质。有物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
三．双缩脲法（Biuret法）
实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫络合物颜的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑沉淀出现，则需要重新配制。
器材：
1. 可见光分光光度计
2. 比杯
3. 大试管15支
4. 旋涡混合器等。
操作方法
1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，
用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm 处进行比测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2. 样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
[目的]
掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。
[原理]
重庆智障学校
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝化合物，在一定条件下，利用蓝深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
[操作]
取试管7支、编号、按下表操作：
立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比，测定光密度值。
操作注意事项：
1．按顺序添加试剂
2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。
[计算]
(一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(二)以测定管光密度值，查标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
[器材]
(一)721型分光光度计
阿穆尔河
(--)恒温水浴箱
(三)中试管7支
(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。
[试剂]
(一)试剂甲
(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液
(2)0.2N氢氧化钠溶液
(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)
suffer软件
(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)
在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。
(一)试剂乙：
(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。
(2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。溶于蒸馏水700ml中，再加85％ H3PO4 50ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml
乙烯利然后过滤，溶液应呈黄或金黄(如带绿者不能用)，置于棕瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。
(三)标准蛋白质溶液
用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mg／ml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。
(四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。
六．考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度
目的要求
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓
度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜形式，红和蓝。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜有红形式和蓝形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl
2，乙醇，（NH
4
）
2
SO
4
无干扰。强碱缓冲液在测定中有一
些颜干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜影响太大而不易消除。
试剂与器材
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