谭振 安徽大学生命科学学院 2002级生物科学
指导老师黄蓓教授
安徽 合肥 230039
【摘要】目的 制备并纯化重组14-3-3蛋白zeta亚型多克隆抗体，对其进行鉴定并检测其效价。方法以诱导大肠杆菌产生的His-14-3-3zeta亚型蛋白为抗原，免疫家兔。用Western Blot方法检测制备的抗血清效价和特异性。 结果 SDS-PAGE检测显示所诱导产生的蛋白为His-14-3-3，用Western Blot 检测显示纯化后的14-3-3zeta亚型蛋白抗体与纯化的His-14-3-3蛋白反应效价为1:50。 结论 已成功地制备出了14-3-3zeta亚型蛋白抗体，为研究14-3-3蛋白在机体生理和病理情况下的作用机制奠定了基础。 【关键词】 14-3-3蛋白；zeta亚型；融合蛋白；多克隆抗体；纯化
Preparation of Polyclonal Antibody
Against Recombinant 14-3-3 Zeta Isoform
Tan Zhen Grade 02, Bioscience，School of Lifescience of Anhui University
Tutor: Huang Bei Professor
Anhui, Hefei, PRC 230039
【Abstract】Objective To prepare, purify and identify the polyclonal antibody against recombinant 14-3-3 zeta isoform.and determine its titer and concentration. Methods The rabbits were immunized with prokaryotic expressed His-14-3-3 fusion protein and the collected antiserum was evaluated by Western blot. Results SDS-PAGE revealed that the protein induced was His-14-3-3. Western blot revealed that the reactive titer of the prepared antibody against purified 14-3-3 protein was up to1:50. Conclusions The polyclonal antibody against recombinant 14-3-3 zeta isoform was successfully prepared and it laid a foundation of study on the action mechanism of 14-3-3 protein physiological and pathological states.
【Keywords】 14-3-3 protein; zeta isoform; fusion protein; polyclonal; purification
14-3-3蛋白是一组高度保守、几乎在所有真核生物细胞都表达的蛋白质家族[1]，根据它 在DEAE-纤维素层析中的组分分布数量和在淀粉—凝胶电泳中的迁移位置而命名。其单体分子量大约30，000，等电点（PI）4.0-5.0[2]。14-3-3蛋白信号分子最先被提出时被认为是神经递质合成的一种介
论文完成时间：2002.6.18
作者简介：谭振，男，1984年6月出生，汉族，安徽合肥人，生物科学专业
质，已被证实能够与不同的蛋白激酶、受体蛋白、酶、结构蛋白、细胞骨架蛋白、细胞周期蛋白、转录调控蛋白以及凋亡蛋白作用[3]。虽然14-3-3蛋白在这些细胞过程中的作用并没有完全清楚。但是已经清楚14-3-3蛋白不仅调节酶的活性，而且是蛋白在细胞内的位置和功能的调节分子并促进蛋白之间的相互作用[3-5]。 目前发现14-3-3蛋白存在于所有的真核生物细胞中，在哺乳动物体内共有7个（β、γ、ε、η、ζ、σ和τ/θ）亚型[6]，分别由不同基因编码。这些亚型最初被定义为α和δ，实际上是β和ζ的磷酸化形式。14-3-3蛋白在脑组织中含量最高，大约占脑组织总的可溶性蛋白含量的1%[7]，分布在细胞质、质膜和细胞内的细胞器[1]。由于14-3-3蛋白可能在神经元的功能中发挥作用，可能参与神经系统疾病的病理生理过程中，因此目前14-3-3蛋白已经成为一个研究热点。
图1：14-3-3zeta三维结构图
14-3-3蛋白家族7个亚型之间高度同源，具有极其相似的三级结构，其每个单体由9个α螺旋（A1-A9）组成，按反向平行的方式排列，彼此间被一短环所间隔，形成一个类似于杯子样的结构，并且其内表面高度保守，是一个两性分子沟，螺旋A3和螺旋A5上极性、带电荷的氨基酸残基构成其极性面，螺旋A7和螺旋A9上疏水的、不带电荷的氨基酸残基构成其非极性面。此两性分子沟是调节14-3-3蛋白与靶蛋白结合的结构基础[8]。此外，在两性分子沟中有一个由49位上的赖氨酸残基（K49）、56位上的精氨酸残基（R56）、127位上的精氨酸残基（R127）等碱性氨基酸残基组成的碱性簇调节14-3-3蛋白和它配体中的磷酰氨基酸相互作用[9]。 14-3-3蛋白的二聚体结构使其能同时结合两个配体。14-3-3蛋白二聚体同时结合两个配体蛋白具有重要作用。在这方面有意义的是许多14-3-3蛋白配体如Raf 1、Cbl等有多个识别基序，通过14-3-3蛋白对两个亲和力低的识别域的双重识别可以促进它们之间的相互作用，如Cbl；反之，14-3-3蛋白也可结合两个亲和力高的部位如Raf1和Bcr或A20的结合[10]。但这些混合物的生理意义还不太清楚，并且14-3-3蛋白的衔接作用只存在于少数特有的配体对。14-3-3蛋白二聚化的另一作用就是亚细胞定位，14-3-3蛋白二聚体中一个亚基与靶蛋白结合，另一个亚基与锚定蛋白结合；根据锚定蛋白的位置，14-3-3
蛋白将靶蛋白定位到细胞内不同的部位。
14-3-3蛋白是细胞当中非常重要的一种蛋白，在细胞的许多生理过程中发挥重要的作用，例如信号
传导、细胞生长、细胞分化、细胞黏附、细胞增殖和离子通道的调节等
[11、12]。尽管确切的功能尚不清楚，但有些机制已经被证实，包括蛋白在细胞内的位置和功能的调节分子并促进蛋白之间的相互作用
实验技术与管理[3-5]。14-3-3蛋白在细胞内的级联作用比较复杂，因为它可能发生在各个水平。
最近的一些研究表明，14-3-3蛋白在细胞生长、增殖和凋亡过程中具有重要的作用。14-3-3蛋白的这些生理功能与14-3-3蛋白同一些重要的信号转导蛋白间的结合有关（图2）。
图
肿瘤 克雅氏病
14-3-3蛋白调节细胞分裂、分化和信号转导这一功能主要体现在它能调节酶的活性，
其是已被证实能够调节Raf 1的活性。Raf 1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞的生长、分化和肿瘤基因的转化中发挥重要的作用。现已经证实14-3-3蛋白能够刺激有活性和无活性的Raf 1的迅速转换，介导Raf 1与
其他蛋白之间的相互联系并且激活Raf 1，例如Bcr 、蛋白激酶C （PKC ）等[13]。Raf 1能够使MAP 激
酶磷酸化，刺激MAPK 从而使基因转录导致细胞分裂[1]。最近的研究发现14-3-3蛋白N 末端的Raf 1
结合位点突变后MAPK 没有被激活，更加说明了14-3-3蛋白在这一过程中的作用[14]。研究已经证实了
Raf 1途径在中枢神经系统的神经元分化和功能上发挥重要作用[15]，尽管在这一过程中每一环节的作用
不是特别清楚，但在运动神经元损害的过程中，Raf 1参与神经变性。此外，Rsk 1途径也是有14-3-3
蛋白调节参与而影响细胞的生长、分化、增殖和存活过程[16]。
wj-600尤细胞的凋亡过程中起关键作用的是凋亡信号调节激酶1（ASK 1），ASK 1能被多种死亡信号刺激并
启动。ASK 1的活性受许多机制所控制，如共价修饰、蛋白-蛋白相互作用等。控制SKK 1功能的蛋白之一就是14-3-3zeta ，14-3-3蛋白家族均能与ASK 1结合，突变分析显示ASK 1与14-3-3蛋白相互作用是在14-3-3蛋白的两性分子构成的凹槽处。研究发现14-3-3蛋白对ASK 1的功能控制是14-3-3蛋白
与ASK 1从胞质向核周围移位有关[17]，这一过程很可能是在内质网完成。14-3-3蛋白结合突变的ASK
后没有改变ASK 在细胞内的位置，也没有14-3-3蛋白的共同表达，这说明是通过控制ASK 在细胞内
的位置来调节ASK 的促凋亡作用[17]。
除了能够调节细胞质酶蛋白之外，14-3-3蛋白还能够调节细胞膜蛋白的活动，尤其是14-3-3蛋白
能够控制质膜H （+）-ATPase 的活性[18]，许多细胞的离子泵和离子通道都能直接或间接的受到14-3-3
蛋白的调节。14-3-3蛋白的结合能够是泵被激活如质膜H （+）—ATPase ，或者活性受抑制如ATP 合酶
复合物的F 型[12]。在大鼠脑氯离子通道蛋白（Clic 4）直接结合14-3-3ζ和DYNAMIN I ，可能影响膜
运输的作用[19]。在人类组织中，HERG 通道就是被14-3-3蛋白修饰过的一个离子通道，能够调节心肌
膜的电压和稳定性[20]。最近在脑组织中也发现了有14-3-3蛋白调节的离子通道，Rajan 等人也证实了
14-3-3蛋白在KCNK 钾离子通道中的作用[21]。
14-3-3蛋白一个独特的特征就是它与转录因子结合成一个复合体发挥其生理效应，最早这是在植物中发现，这使14-3-3蛋白参与信号转导转入细胞核内。目前，虽然14-3-3蛋白与转录因子的相互作用免疫沉淀法和酵母双杂交法已经得到证实，但14-3-3蛋白与转录因子的相互作用的生化功能尚不清楚。 ：14-3-3蛋白在信号转导中的作用及与其相关的疾病
阿尔兹海默氏病 米勒·迪克综合症 损伤 帕金森氏病 Bad Cdc25 FKHRL1 Raf 14-3-3蛋白细胞凋亡 限数增殖 细胞周期 基因转录 图2：14-3-3蛋白在信号转导中的作用及与其相关的疾病
信号转导蛋白14-3-3是一组高度保守的具有调节作用的蛋白质家族，广泛分布于真核生物细胞内，在哺乳动物脑组织中含量为13.3微克/毫升，约占脑蛋白总量的3%，主要位于神经元。正常情况下存在于胞浆内，在脑脊液（CSF）中含量甚微。在一些神经系统疾病患者的CSF中出现14-3-3，推测是由于大量神经元细胞被破坏，致其漏入CSF所致。14-3-3浓度可能与神经元破坏程度成正比[22]。近年
来CSF中14-3-3的检测逐渐成为脑组织退行性疾病和中枢神经系统感染性疾病的辅助诊断方法。有研究表明，在帕金森疾病（Parkinson’s disease）的免役组化调查中14-3-3蛋白呈强阳性[23]。CJD是一种有朊蛋白引起的快速进行性痴呆综合症[24]，CJD的临床表现因人而异，故无特异性[25]，并且病程进展迅速，通常到晚期才被怀疑，临床诊断较为困难。因此，早期预测性诊断非常重要。目前认为，人CSF 中14-3-3蛋白的出现对散发性CJD具有很高的早期诊断价值[26]。
其中14-3-3zeta亚型在脑中含量最高；而且与cdc25有特异性高亲和力的位点；在MAPK级联反应中具有抑制ERK、增强JNK和P38MAPK通路的作用；同时在血液中与血小板糖蛋白Gp Ib/IX/V作用影响血小板黏附等，14-3-3zeta亚型越来越受到重视。制备14-3-3zeta亚型抗体，揭示其在体内的分布规律，对研究14-3-3zeta蛋白在机体生理和病理情况下的作用机制具有重要的作用。
1． 材料和方法
1.1 材料与试剂
1．1．1 实验器材
塔兔2只（体重约3kg） 购自安徽医科大学
pDEST17-zeta/BL21重组菌株 本实验室构建保存
GelDoc凝胶成像系统 BIO-RAD
硝酸纤维素薄膜 BIO-RAD
各型微量加样器 上海医用激光仪器厂
4℃，-20℃冰箱 美菱
-80℃冰箱 Forma Scientific
MLS-3750灭菌器 三洋
YC-1层析实验冷柜 北京仪诚科技公司
Centrifuge 5417R高速冷冻离心机 Eppendorf
THZ-82台式恒温振荡器 上海跃进医疗器械四厂
TY-80S脱摇床 南京大学
超净工作台 Streamline laboratory products
Ultrospec 3100 pro紫外分光光度计 Biochorm Ltd.
电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司
蛋白质电泳仪、电泳槽、转膜槽 上海天能科技有限公司
JY92-2D超声波细胞破碎机 宁波新科器研究所
WH-2微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司
1．1．2 实验试剂
1．1．2．1 主要试剂
完全福氏佐剂、不完全福氏佐剂 中国科学院上海生物化学研究所
小牛血清 中国医学科学院生物工程研究所
His-tag beads Novagen公司
二抗、SDS 华美生物工程公司
低分子量标准蛋白质 上海生物化学研究所
合成His、合成zeta、甘氨酸 上海生工生物工程有限公司
丙烯酰胺、N，N甲叉双丙烯酰胺 Xiamen Sanland Chemicals Company Limited.
蛋白胨、酵母膏 Oxoid Ltd.
1．1．2．2 主要试剂配置方法
His-14-3-3zeta的诱导表达试剂
①LB/Amp平板
蛋白胨 1g
酵母膏 0.5g
NaCl 0.5g
琼脂糖 1.8g
双蒸水 100ml
121℃高压灭菌20min，冷却到60℃以下加入100μl 50mg/ml无菌氨苄青霉素混合均匀，无菌操作倒平板
②LB液态培养基
蛋白胨 1g
酵母膏 0.5g
NaCl 0.5g
双蒸水 100ml
121℃高压灭菌20min，临用前加入50mg/ml无菌氨苄青霉素，使其终浓度达到50μg/ml
③0.2mol/L IPTG
1g IPTG 溶于4g 双蒸水中，过滤除菌，分装放在-20℃保存
SDS-PAGE主要试剂
①40%丙烯酰胺N，N’-亚甲双丙烯酰胺
丙烯酰胺 18.75g
N，N’-亚甲双丙烯酰胺 0.5g
双蒸水 50ml
②4×浓缩胶缓冲液 pH=6.8
Tris 6.05g
双蒸水 100ml
用浓HCl调pH至6.8，4℃保存
③4×分离胶缓冲液 pH=8.8
Tris 18.15g
双蒸水 100ml
xdelbox
用浓HCl调pH至8.8，4℃保存
④10%过硫酸铵溶液
Ap 0.1g
双蒸水 1ml
4℃保存
⑤20%TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）
TEMED 0.2ml
双蒸水 0.8ml
4℃保存
⑥0.1%溴酚蓝
溴酚蓝 0.1g
双蒸水 100ml
4℃保存
⑦6×加样裂解液
Tris（pH6.8） 7ml
讲道集
甘油 3ml SDS 1g
DTT 0.93g
溴酚蓝 1.2mg
加双蒸水定容至10ml，-20℃保存
⑧电泳槽缓冲液
Tris 1.5g Gly 7.2g SDS 0.5g招股说明书
双蒸水 500ml
⑨染液
考马斯亮蓝R250 0.25g 双蒸水 227ml 甲醇 227ml 冰醋酸 46ml
⑩脱液
甲醇 227ml 冰醋酸 46ml
双蒸水 227ml
Western Blot
①TBS
Tris-base 2.42g NaCl 29.2g 用浓HCl调pH至7.5，并定容至1000ml
②TBST（TBS+0.1% Tween 20）
TBS 200ml Tween 0.2ml ③blocking buffer（5% milk in
TBST）
TBST 40ml Milk 2g
④transfer buffer
Tris 2.25g Glycine 14.4g Methanol 150ml 用双蒸水定容至1000ml
网剧中披露他人手机号码构成侵权⑤primary-antibody
1：50一抗 500μl TBST 4.5ml 小牛血清 0.5ml ⑥second-antibody
1:50二抗（羊抗兔） 500μl TBST 4.5ml 小牛血清 0.5ml
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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