紧密连接相关蛋白Claudin-5、ZO-1在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的表达及意义 陈铎;袁江伟;宋磊;魏翔泰;关俊宏;刘云会;宗志红
【摘 要】目的通过观察大鼠蛛网膜下腔出D-（SAH）后早期脑皮层紧密连接相关蛋白Claudin－5、ZO－1表达的变化及JNK抑制剂SP600125对其表达的影响，探讨SAH后早期脑损伤的机制。方法成年雄性SD大鼠75只，随机分成假手术组（sham组）、SAH组、SAH＋DMSO组、SAH＋sP600125（10mg／kg）组和sAH＋sP600125（30mg／kg）组5组。采用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型，在SAH后24h时，应用电镜观察各组脑皮层微血管血脑屏障形态学变化；应用Western blot检测各组中脑皮层Claudin－5、ZO－1表达的变化。结果SAH后早期脑皮层微血管发生明显损伤改变；与sham组相比，SAH组出血后24hClaudin－5、ZO－1的表达水平明显降低（P〈0．05），c-Jun氨基端激酶（JNK）抑制剂SP600125明显改善了脑皮层微血管形态学损伤程度，并抑制了Claudin－5、ZO－1表达水平的降低。结论大鼠SAH后早期血脑屏障结构破坏是早期脑损伤关键性机制之一；SP600125可能通过抑制细胞凋亡、保护血脑屏障发挥SAH早期脑损伤的神经保护作用。 【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】2010(000)009
【总页数】4页(P713-716)
【关键词】蛛网膜下腔出血;早期脑损伤;紧密连接相关蛋白;血脑屏障;大鼠
【作 者】陈铎;袁江伟;宋磊;魏翔泰;关俊宏;刘云会;宗志红甜素纯
胆盐【作者单位】
【正文语种】中 文
【中图分类】R743.35
最新的研究结果显示，蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后72 h内存在早期脑损伤（early brain injury，EBI），3～5 d 后发生脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS），上述二者是造成SAH患者死亡或重残的最主要原因［1］。然而，EBI的确切分子病理机制尚不清楚，细胞凋亡机制可能参与了其发生、发展过程［2］。c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N terminal kinase，JNK）信号转导通路参与了多种疾病的细胞凋
亡过程［3］。脑损伤后发生的脑水肿病理改变与血脑屏障的开放密切相关，Claudin-5和ZO-1是最重要的脑血管内皮细胞紧密连接相关蛋白，它们的异常在血脑屏障开放中起关键作用［4，5］。本研究拟通过检测大鼠SAH后早期脑皮层微血管紧密连接相关蛋白Claudin-5和ZO-1的表达及JNK抑制剂对其表达的影响，进一步探讨SAH后早期脑损伤的机制。 1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康成年雄性SD大鼠75只，体质量300～350 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（sham组）、蛛网膜下腔出血（SAH）组、SAH+DMSO组、SAH+SP600125（10 mg/kg）组 和 SAH+SP600125（30 mg/kg）组，每组15只。SAH+二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、SAH+SP600125（10 mg/kg）和SAH+SP600125（30 mg/kg）组。在建立SAH模型基础上分别于实验前1h和实验后6h向腹腔内二次注入载体药物DMSO（Calbiochem公司）或JNK抑制剂SP600125（Sigma公司），每组大鼠中5只用于电镜形态学观察，10只用于Western blot检测Claudin-
5、ZO-1的表达。
1.2 大鼠SAH模型的建立
采用血管内穿刺法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型［6］：用 10%水合氯醛（300 mg/kg）经腹腔注射麻醉后，气管内插管，固定头部及四肢，做颈部正中3 cm切口，分离暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，电凝切断颈外动脉近分叉处分支（包括枕动脉、甲状腺上动脉及咽升动脉），分离结扎并切断颈外动脉，使颈外动脉近心端成一约5 mm长的残端，用2个无损伤动脉夹分别夹闭颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉起始段约3～5 mm处用眼科剪剪一“V”型小切口，下拉颈外动脉，与颈内动脉成一直线，再将1根长约5 cm的3-0尼龙线从颈外动脉上的“V”型小切口导入，经颈总动脉达颈内动脉，松开颈内动脉上的动脉夹，顺着颈内动脉向远端继续插入尼龙线至颈内动脉颅内段，有小的阻力感后再插入约2～3 mm刺破颈内动脉分叉部，迅速抽出尼龙线，用动脉夹夹住颈外动脉残端，松开颈总动脉上的动脉夹恢复血流，结扎颈外动脉残端，缝合颈部切口。术中股动脉插管接多导生理仪监测血压，维持肛温（37.5±0.5）℃，并定时测血气分析。sham组除了不刺破血管壁外，其余操作均与SAH组一致。 强调结构
1.3 透射电镜观察大鼠脑皮层微血管超微结构
SAH模型建立24 h后处死大鼠，2%戊二醛溶液进行全身灌流，在冰盘内摘取大鼠脑皮质组织，迅速切成1 cm×1 cm×1 cm的小块，3%戊二醛溶液中预固定，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗，1%固定，梯度乙醇脱水，定向包埋，定位后制成超薄切片，经醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染后，于透射电镜下观察、鉴别皮层神经元与皮层微血管组织，并照像。观察脑皮层微血管超微结构变化。
1.4 Western blot检测Claudin-5、ZO-1表达的变化
取各组大鼠新鲜大脑皮质，常规提取蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，4℃转膜过夜，5%脱脂奶粉封闭；加入1∶500稀释山羊抗鼠多克隆抗体（Santa公司），4℃孵育过夜；二抗室温孵育2 h，DAB显，照像。以GAPDH作为内对照。胶片扫描后，用Scion Image for Windows软件分析各条带的平均灰度值。
1.5 统计学分析
msn保护盾应用SPSS13.0统计软件。计数资料用率表示，采用t检验；计量资料用x±s表示，各组之间
行ANOVA方差分析。P＜0.05表示有统计学差异。
2 结果
2．1 大鼠SAH后24 h神经行为功能缺损评分
SAH后24 h对存活大鼠参照Bederson法［7］进行神经行为功能缺损评分，结果见表1。在SAH组和SAH+DMSO组中神经行为功能缺损评分集中在3 分和 4 分；SAH+SP600125（10 mg/kg）组集中在 2分和3分，而SAH+SP600125（30 mg/kg）组集中在1分和2分，说明JNK抑制剂SP600125可改善SAH存活大鼠神经行为功能缺损，SP600125（30 mg/kg）组尤为明显；sham组无死亡，SAH组、SAH+DMSO组、SAH+SP600125（10 mg/kg） 组、SAH+SP600125（30 mg/kg）组死亡率分别为30%、35%、25%、15%，各组间比较无统计学差异（P＞0.05）。
杂志社表1 SAH后24 h大鼠神经行为功能缺损评分及死亡率Tab.1 Neurological deficit scores and mortality after SAHGroup Neurological deficit scores Mortality（n=20） 0 1 2 3 4 （n/%）Sham 20 0/0 SAH 2 0 3 6 3 6/30 SAH+DMSO 2 0 1 7 3 7/35 SAH+SP600125（10 mg/kg） 0 1 5 7 2 5/25 SAH+SP600125（30 mg/kg） 0 5 8 3 1 3/15
2.2 SAH大鼠脑皮层微血管组织形态学变化及SP600125抑制剂对其影响
透射电镜的结果（图1）显示，sham组大鼠脑皮层微血管内皮细胞呈梭形，胞膜连续完整，细胞核形状不规则，核膜尚完整，胞质内有较多核糖体、线粒体及粗面内质网等细胞器，相邻内皮细胞间可见紧密连接，血脑屏障未开放；SAH组和SAH+DMSO组血管内皮细胞多凸向管腔，细胞核形不规则，有切迹，核内异染质明显边集，细胞基质密度降低，线粒体等细胞器减少，相邻内皮细胞间紧密连接明显松散，血脑屏障明显开放；SAH+SP600125（10 mg/kg）组细胞核形不规则，有切迹，核内异染质明显边集，核膜部分模糊，细胞质内囊泡增多，相邻内皮细胞间紧密连接近腔面有部分松散，血脑屏障呈部分开放；SAH+SP600125（30 mg/kg）组细胞核形不规则，有切迹，细胞膜部分破坏，胞质内可见空泡，变性的线粒体、粗面内质网扩张，相邻内皮细胞间紧密连接呈部分松散状态，血脑屏障呈部分开放。
2.3 SAH大鼠脑皮层微血管紧密连接相关蛋白Claudin-5和ZO-1的表达及SP600125对其影响
Western blot结果（图2）表明，SAH组和 SAH+DMSO组Claudin-5和ZO-1表达水平下调，
较sham组具有统计学差异（P＜0.05）；SAH组和 SAH+DMSO组之间比较，无统计学差异；与SAH、SAH+DMSO 组比较，SAH+SP600125（10 mg/kg）组Claudin-5和ZO-1的表达下调未受到明显抑制（P＞0.05）；SAH+SP600125（30 mg/kg）组 Claudin-5 和 ZO-1 的表达下调则受到明显抑制，10 mg/kg与30mg/kg SP600125两组间比较具有统计学差异（P＜0.05）。结果补语
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