山西医科大学学报，2021年4月，第52卷第4期-451-
常虎林1，，房国栋5，万永"，刘司南"，张靖篧"，耿西林3，*(西安交通大学第三附属医院肝胆外科，西安710068；5西北工业大学附属医院肝胆外科；西安交通大学第三附属医院病理科;4西安交通大学第一附属医院肝胆外科；*通讯作者, E-maiRfenpi/n_)
摘要：目的探讨二甲双M(metformin,MET)在对乙酰氨基酚(bemmioopheo,APAP)诱导小鼠急性肝损伤动物模型中的抗损伤及抗炎作用。方法采用小鼠腹腔注射APAP法诱导急物性肝损伤。39只小鼠按随机数字表法分为空白对照组、药物性肝损伤组(APAP组，腹腔内注射350mpSy APAP溶液)及二甲双胍处理组(APAP+MET组，于APAP暴露前30 mw腹腔注射MET400mPk)。处死小鼠后取小鼠的血液标本，检测各组小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的变化,ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-a(TNF1)及白介素-6(IL4)的水平，取肝脏组织检测其功能及病理变化,WeWern blot法检测肝组织中pCNK、JNK的表达变化。结果与对照组相比,APAP组病理学显示大量的炎性细胞浸润，肝组织结构明显被破坏；血清AST、ALT、TNF a和ILA水平明显升高(P<0.05)；pANK蛋白表达升高(P<0.05)。与APAP组相比, APAP+MET组小鼠血清病理损伤明显减轻；血清AST、ALT、TNF a和ILA水平下降(P<0,05)'pNNK蛋白表达水平降低(P< 0.05)o结论MET预处理能够显著抑制APAP诱导小鼠急性肝损伤炎症因子的释放并对肝脏功能具有保护作用，这种保护作用可能与减少JNK磷酸化有关。 关键词：二甲双胍；对乙酰氨基酚；oJuxA端激酶；急性肝损伤
中图分类号：R563文献标志码：A文章编号：577-6611(2721)74-7451-75DOI：17.13753/(.imx.577-6611.2721.74.75
Protective role of metformin aaainse acetaminophen-induced achte livec injury in micc
CHANG Hu/n11,FANG GuoUona8,WAN Yong4,LIO Sioan4,ZHANG Jingyao4,GENG Xi/o19*(Deparenect of Henatobiliare Sar-yd'e,Thoe Aftoated Hospitat fXt'n Jiaotony Universio,Xt'n710066,China；2Decartmect of Hecatobiliare Sure er e；SAftOaten Hospitat f NortOwestere PolytechrCcoO Unoersito,3Decartmeci f PatOolof-y；Thirt AfiOOed Hospital of XO'n Jiaotonn Unoersi-m Depatmen f Hecatobiliare Sureere,Firsi OAOOed Hospitat of Xi't Jiaotonn University；*CorresponCOn autOos,E-mait:fennxi-U o_xa@160)
Abstroci:Objectiec To investigate the protective ehect of metformin(MET- pretreatmect ayainst acemmioophec(APAP--induced acute liver injuy in mice and its potecPoi mechanism.MetOofs Thirty male C57BL/6mice(6-8weeds olU)were randomly dWid-ed into bmnd control yroup,liver injuy moPei yeup(APAP yeup)APAP+MET yeup.The mice in APAP yeup were intyper-itonea/y tnjecmd with350mpky APAP,while the mice in APAP+MET yeup were intrapedwneally tnjecwd with440mp j kp
O) MET before the treatmect of APAP.BlooP samples were ccllecwd ot24h after APAP moPehng to determine the serum levels of aspor-mw transaminase(AST),amnino transaminase(ALT),tumor necrosis factosP(TNF-p)and inWrleuPinL)(IL-P-.The liver tissues were collected to assess oyao function and patholouicai changes.The expression of p-JNK and JNK in liver tissue was OeWcWd by Western blot.Resulii Compared with control yeup,the OestructWn of liver structure and the iCWytion of inUammatoy cells were more oUvious in APAP yeup.Compared with control yeup,t he serum levels of ALT,AST,TNF-c,IL-P were increased in APAP heup(P<0.05-,and the expression of p-JNK proWin W liver tissue was also inceased(P<0.05-:Compared with APAP yeup,the serum levels of ALT,AST,TNF-c,IL-P were decreased in APAP+MET aeup(P<0.05-,the hisWuatholoaicai aCoormab/os were attecuawd,and the expression of p-CRK proWin in liver tissue was significantly decreased(P<0-05-:Conclusion MET on protect ayainst APAP-Wduced acute liver injuy,which may bo related to the dowo-regum/on of p-JNK expression.
Keywol'ys：metformin；acemmioophec；JNK；acute liver injuy
杨白冰模式
对乙酰氨基酚(ootdmiooppL,APAP)是一种临床上广泛应用的解热镇痛药，剂量下APAP 安全可靠［］。近年来，由其过量或不当应用引发的肝脏毒性损伤正呈上升趋势，成为药物诱导肝损伤及急性肝功能衰竭的主要原因［2］o据统计在美国约一半的急性肝衰竭是由APAP服用过量引起的,
基金项目：陕西省自然科学基金项目(2020JQ-945-
作者简介：常虎林，男，1988-01生，硕士，主治医师,E-mbRchbiahu/ 收稿日期：2020-11-17
・452・J Sha/i Med U/v,Apr.2021,Vol52No4
我国急物性肝损伤住院患者也逐年递增[2]o 临床上有洗胃、APAP解毒剂应用、营养支持等方式，严重者考虑肝移植。现有研究结果表明，高剂量的APAP会使葡萄糖醛酸化和硫酸化途径饱和，产生过量的NAPQT9]，超出体内还原型谷胱甘肽（GSH）系统的清除能力，从而反应性增加活性氧（reactive oxyyen species,ROS）的积累，触发cWuhW 端激酶（c-Jun N-terminal kinasa,JNK）的磷酸化，JNK的持续激活在APAP诱导肝细胞死亡中起到核心作用⑷。
二甲双胍（metfomix,MET）是目前临床常用的2型糖尿病的药物之一。近年来的研究还发现met可用于多囊卵巢综合征、肥胖、心力衰竭和高血压等疾病的J]o同时，有报道称met对非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝、CCh或甲氨蝶吟引起的肝中毒反应均有保护作用^3。但是,MET 对APAP诱发的急物性肝损伤是否发挥保护作用尚待研究。
本研究中，我们应用APAP肝损伤动物模型，研究了MET对APAP诱导的急性肝损伤的保护作用，并初步探索了这种保护作用的分子机制。
1材料与方法
01主要材料和试剂
4-8周C57Ba/k雄性小鼠由陕西省人民医院实验中心提供。二甲双胍（格华止，国药准字H20023371），由上海施贵宝制药有限公司提供。JNK羊抗鼠单克隆抗体和p-JNK羊抗鼠单克隆抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供;TNF-p和IL-9 检测试剂盒由深圳达科为生物技术有限公司提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技术有限公司提供。APAP溶液的配制（将0.5a APAP粉剂溶于100ml 生理盐水中，在40°C水浴锅中晃动充分溶解、混匀，按354ma/ka剂量给药准备）o索南加乐
02实验方法
02-1模型制作和实验分组6-8周龄BALB/c 雄性小鼠（22-25a）37只随机平均分为3组:①空白对照组（contmt组）；②药物性肝损伤组（APAP 组），腹腔内注射356ma/ka APAP溶液，作用24X；
③二甲双胍处理组（APAP+MET组、，于APAP暴露前30mix腹腔注射MET440ma/ka，后给予APAP溶液，作用24h；各组小鼠均在APAP暴露24h 后处死，及时采集血液样本和肝组织样本。
1.2.2血清ALT、AST水平的测定根据谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）检测试剂盒，测定血清ALT、AST水平。
1.2.3肝组织病理学检查取出分离后的肝脏组织利用4%甲醛溶液固定，常规苏木精-伊红（HE）染，观察肝组织病理学改变。
1.2.2炎症相关因子的测定根据ELTA检测试剂盒说明书指示，测定血清TNF-、IL-9含量。
1.2.5c-Juh-N端激酶（c-Jun N-terminai kinxsa, JNK）的表达测定精密称取各组小鼠肝组织，根据RIPA裂解液使用说明书制备肝组织匀浆，肝组织与RIPA裂解液的比例为1ma：7.5pi，用玻璃匀浆器上下、旋转充分碾磨。在冰上裂解25mix后,16000g离心37mix，取上清，利用Westeru blot检测各组小鼠肝组织p-JNK/JNK（稀释比1：800）表达的变化，应用p-actio作为内参校正。
1.2.2统计学处理采用SPSS17.2软件进行分析，正态分布的计量资料以均数土标准差（x±i形式表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-1检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1MET对APAP诱导急性肝损伤小鼠AST、ALT的影响
与对照组相比,APAP组小鼠血清AST和ALT水平显著升高，差异均有统计学意义（分别为10.25, 1016，均P<0.25）o而APAP+MET组AST、ALT水平明显低于APAP组，差异均有统计学意义（分别为12.31,12.83,P<0.05，见图1）。
2.2MET对APAP诱导急性肝损伤肝组织病理改变的影响
与对照组相比,APAP诱导肝损伤小鼠肝组织内可见肝小叶结构模糊，肝索排列紊乱，形态失常，肝窦内多发炎性细胞浸润，正常的肝组织结构明显破坏；而上述改变在APAP+MET组小鼠中得到缓解（见图2）o
2.3MET对APAP诱导急性肝损伤炎症因子水平的影响
用ELTA法检测各组小鼠的TNF-P和IL-9的水平，结果显示,APAP组TNF-P和IL-9水平均较空
山西医科大学学报，2021年4月，第52卷第4期-453-
与空白对照组比,P<0.05；与APAP组相比，常<0.05
图1MET处理对APAP诱导急性肝损伤AST,ALT的影响
Figure1EEect of MET on AST anh ALT levels is APAP-inhuceh acute lives injup mice
A.空白对照组
B.APAP组
C.APAP+MET组
图2MET处理对APAP诱导急性肝损伤肝组织病理改变的影响(HE染，x220) Figure2EEect of MET on patUolovica)cUan/es is APAP-inVuceh acute lives injup mice(HE staining,x220)
白对照组明显升高，差异均有统计学意义（分别为27.57,8.25，均P<0.45）；相较于APAP组,APAP+MET组TNF w和IL-P水平明显下降，差异均有统计学意义（分别为16.22,11.44,2匀P<0.05，见图3）。
与空白对照组相比，*P<0.45；与APAP组相比，炉<0.05
图3MET处理对APAP诱导急性肝损伤血清TNF w和IL-9水平的影响
Figure3EEect of MET on tke serum TNF-w an)IL-9levels is APAP-inVuceh acute lives injup mice
2.4MET通过减少JNK磷酸化减轻APAP致肝损伤
用Wester/blot法检测小鼠肝组织匀浆内p JNK J NK的表达，应用p-actis内参校正后，空白对照组、APAP组和APAP+MET组肝组织内JNK含量差异无统计学意义。与空白对照组相比，APAP 组肝组织内P-JNK含量明显增多，差异有统计学意义（=7.49,P<0.45）；而APAP+MET组小鼠肝组织内p-JNK含量较APAP组明显减少，差异有统计学意义（=8.79,Pv0.05，见图4）
o
-454-J Shanxi Med Unia,Apr.2021,Vol52No4
与对照组相比0P<0.05；与APAP组相比，炉<0.05
图4MET对APAP致肝损伤小鼠pANKJNK的影响
安持人物琐忆 pdfFigure4EEect of MET on tie expression of p-JNQJNK in liver tissxe
3讨论
肝脏是药物在人体中代谢和清除的部位，药物导致的肝损伤近年来备受关注。APAP作为其中被研究最多的药物之一，其过量摄入可导致严重的肝脏损伤，甚至急性肝衰竭⑴。现有研究结果发现APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型中，坏死的肝细胞释放损伤相关分子模式（damage-associate/mole-chlar patterns,DAMPs[,DAMPs则可被肝内中性粒细胞等识别，并使得这些炎性细胞被激活口4，进一步释放各种炎性因子如TNF-a和IC-9，从而加重炎症反应及细胞损伤。炎症反应被认为是APAP致急 性肝损伤的基本机制之一。
MET作为临床2型糖尿病的一线药物，具有良好的安全性和性价比。MET主要通过抑制肝糖原新生、调节胰岛素受体信号等方式调节血糖。临床研究发现可以通过抑制炎症反应等方式来减轻急性呼吸窘迫综合征、肠道缺血再灌注损伤、脑脊髓炎等疾病的组织损伤口1-3。本研究中，我们尝试探讨MET 在APAP诱导肝损伤的潜在作用。实验发现MET 可显著降低模型小鼠血浆中转氨酶水平的异常升
高并对肝组织病理学损伤有所改善，同时炎症相关因子TNF-a和IC-9的表达也明显受抑，以上结果证实met在APAP肝损伤中具有抗损伤和抗炎作用。
JNK已被证实在多种组织器官（包括肝脏）的损伤、应激、细胞生存与凋亡等方面起着重要调节作用。Guxawax等〔⑷通过小鼠和体外细胞培养的研究发现在APAP导致的肝损伤中JNK被持续激活，并且发现JNK抑制剂SP60035在体外和体内对APAP肝毒性有显著的保护作用。Win等〔⑸研究发现，沉默JNK在线粒体膜上结合位点Sad，可抑制JNK的持续激活和JNK在线粒体膜上定位，对APAP诱导的肝脏损伤起到保护作用。因此MET 能否通过抑制JNK的激活对急性肝损伤发挥保护作用值得进一步探讨。本研究中，与空白对照组比较,Western blot结果显示APAP致肝损伤时JNK的磷酸化明显增多。而MET干预后,pANK的表达含量又比APAP组明显减少，提示MET预处理可减少APAP致肝损伤时JNK的磷酸化。
本研究证实了met通过抑制JNK的磷酸化对APAP诱导急性肝损伤发挥保护作用。提示二甲双胍具有急性肝损伤的潜在价值，并为其提供新的理论依据。但JNK信号调控网相当复杂，更全面的分子机制仍需进一步深入研究。
参考文献：
[1]Lee WM.Acetami/ophes(APAP/hepatotoxicityAsn'4ti/e for
APAP to go away?[J]J Hepatol,2017,67(6)6324-1331.
[2]EEo P,Brass,Ran/y(,et al.Poison center exyosnres Cxc to
tUerapestic misuse of xon/rescri/tion acetamixophex-jontaining
combination proPxcts in tie UniteS States2207-2019[J].C/n
Toxicol(Ph/a),2218,57(5)：354-355.
[3]Chowdhura A,Lx J,Zhang R,et al.Mangiferin ameliorates ac-
etamixophen-in/pceS hepatotoxicity tUroup/APAP-Lys anh JNK
moPulation[J].BiomeS PharmacotUer,2019,117：109097-
146106.
[4]Torres S,Baxlics A,I/sausti-ArVia N,et ah EnCoplasmic retic
ulum stress-inCxceS upreyulation of STARD1promotes acetamin-
op2es-inCxceS acota liver failure[J].GasUoesterology,2219,
157(2)652-568.
[5]Zhou J,Massey S,SW/D,et al.Metformin:ax old Crup witl
new applications[J].I/t J Mot Sci,2018,3(3)：2363-
2874.
[6]吴鹏波，宋琪，俞媛洁，等•二甲双胍对非酒精性脂肪性肝病
细胞模型线粒体途径凋亡及氧化应激的影响[J]中华肝脏
病杂志,2420,28(1)：64-
68.
山西医科大学学报，2021年4月，第52卷第4期-455-
[7]Bergheim I,Guo L,Davis MA,d at Mehbsnix preveuts alee-
hol-induceU lives injuy W the mouse:crihcai role of plasmidovex
activator indibitor-f[J].GaWeeuteeUp:2706.137(7):2799-
4110.
[5]Yau Y,Jun C,Lu Y,ci at.Combinatiou of metfosnio and luteo-
Uo syyergistically protects cardox tetrachlodOe-induceU hepaW-
toxicity:mechanism iuvolves antioxidaut,anh-inUammatoe,ax-80式通用机
tiapoptotic,and NdU/HO-1signaling pathway[J].Bic Factors,
2719,45(4)：368-606.
[9]Rizh FH,El Saadaxy AA,DawooP L,d at Metformio amehorv-
ted methotsxaW-WOuceU hepaWeuai toxicity io rato io addi/ox
to its antitumor activity:two birds with oue stoue[J].J InUamm
Res,2413,5(11)：221-429.
[14]Yang R,Tonxesseen TI.DAMPs and sterile inUamma/ox io dyp
hepatotoxicity[J].Hepatol lot,245,13(1)：22-54.
[11]SuP JY,Mi CS,Jinwoo L,cd at EEect of preaOmissiou metform-
2-use ox clinical outcome of acute espieWe distress syndsme
amoug cd/ca/y Pl pa/exts with diabetes[J].TuPerc Respis
Dis,275,87(3)：299-373.
[12]Jia Y,Cui R,Wang C,d at Metfosnio protects against intesP-
nal ischemia-speSusRu injuy and cell pyroptosis via TXNIO-
NLRP-GSDMD pamway[J].Redox Biol,2727,32(4)：
梦醒五棵柳51534-51544.
[13]Yafei S,Tiao T,Juao G,cd at Metformio ameliorates the devel-
opmeut of experimental autoimmune excephaUmyeh/s by repulo-
ting T helper5and regulatoy T cells io mice[J].J Neuroim-
muuoi,2710,15(292)：53-67.
[14]Guuawao BK,Lio ZX,Hao D,d at c-Juu u-tesninal kinase
plays a major role io mudue acetamixophex hepaWWxiciW[J].
Gastroeuterolop,2706,131(1):55-175.
[15]Wio S,Thao TA,Hao D,d at c-Juu u-tesninal kinase(JFK-
dependext acute lives injug fem acetamixophex or tumor uecro-
宽带直流放大器
sir factor(TNF)requires mitochoudrial Sad proteix expressWu io
mWe[J].JBRiChem,2711,236(47-：3C071-3C073.
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议