实验步骤有机氟 | 实验原理 | |
1 氟碳表面活性剂 | 让菌复苏，进入对数生长的早中期 | |
2 | 取100ul初培养物加入到25mL SOB (无抗生素)培养基中，20℃，100rpm过夜培养公益海报设计论文 | |
3 | 取12ml培养物置于50mL的灭菌离心管中，冰浴10分钟，2500rpm，4℃离心10分钟，弃上清，倒扣去除残留培养基 | 使细菌的生长停止，代谢减慢 |
4 | 菌体重悬于4mL冰冷的高效转化缓冲液中（注意：温和悬浮,防止细胞破铝箔裂导致大量细胞死亡） | 低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，细菌细胞膨胀成球形，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，细胞膜通透性发生变化，极易与转化混合物中的DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物 |
5 | 琉璃砂菌体重悬于1mL冰冷的高效转化缓冲液中 | 除去所有的培养基残留物以及细胞破损后释放出来的细胞内含物 |
6 | 加入75ul DMSO,混合均匀后，冰上放置10分钟 | DMSO为抗冻剂，但会降低转化率 |
7 | 将悬浮液等份（50ul）分装到无菌的离心管中，液氮中速冻 | 低温对大肠杆菌保存有利，温度越低保存时间越久 |
8 | 取冷冻的感受态细胞迅速融化，放冰上10分钟 | 冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡 |
9 | A：加入2uLpET32a(+)质粒，冰浴30 min受体菌 B: 另一管感受态细胞中篮球规则的演变加入2uL无菌双蒸水作为阴性对照 | 阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性 |
10 | 热激 42℃，90秒，冰浴2 min | 在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内 |
11 | 加入800uL无抗生素的SOC培养基，37℃复苏45分钟 | 用SOC复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长 |
12 | 取20ul, 50ul细胞悬浮液直接在含50ug/mL氨苄青霉素的LB培养基上铺平板，倒置平皿37℃培养过夜，出现菌落（注意：因为抗生素高温易失活，所以应等到培养基热而不烫时加入抗生素） | 这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。这是因为目的菌落的抗性基因使的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落 |
本文发布于:2024-09-20 21:22:58，感谢您对本站的认可！
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