熊春翔;宗少晖;曾高峰;韦波;赵玉玺
【摘 要】目的:建立并评价大鼠Allen's脊髓损伤模型,为进一步研究脊髓损伤机制提供实验动物参考.方法:SD大鼠60只,体重230～270 g,随机分为空白组(20只),手术组(20只),功能评价组(20只).空白组不做任何处理,手术组和功能评价组都采用Allen's法致伤.功能评价组作手术前后的BBB功能评分和斜板试验,空白组与手术组作病理切片HE染.结果:功能评价组术前斜板度数和BBB评分均高于术后(P<0.05).手术组术后1 d脊髓神经元发生退变和坏死.结论:本实验建立的大鼠Allen's脊髓损伤模型方法可靠,易于复制,可用于脊髓损伤的相关研究. 【期刊名称】《广西医科大学学报》
【年(卷),期】2011(028)002
【总页数】3页(P215-217)
【关键词】脊髓损伤;Allen法;BBB评分;大鼠
核心交换机【作 者】熊春翔;宗少晖;曾高峰;韦波;赵玉玺索溪峪的野教学设计
【作者单位】广西医科大学研究生学院;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科,南宁,530021;广西医科大学公共卫生学院;广西医科大学公共卫生学院;广西医科大学研究生学院
大学诗词写作教程
【正文语种】中 文
【中图分类】R744
脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)的发病率近年不断升高,但是目前对脊髓损伤的研究进展缓慢,其效果不佳,主要因为脊髓损伤的发病机制复杂,缺少一个较理想的脊髓损伤模型用于脊髓损伤的研究。Allen[1]在1911年创造了垂直打击脊髓用于建立脊髓损伤模型的方法。由于此法很接近于人类SCI发生过程,临床相关性好,适用于SCI的研究。但此模型具有打击力度不均和无法进行定量分析等缺点。因此,本实验拟建立改良型的大鼠Alien's脊髓损伤模型,通过改良Rivlin斜板试验[2]和脊髓运动功能 BBB(Basso,Beattie and Bresnahan)评分法[3]及病理切片HE染,观察急性损伤后大鼠脊髓功能的变化情况,为进一步研究SCI机制提供实验动物参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物:清洁级健康SD大鼠(雌雄不限)60只,体重230～270 g,购于广西医科大学动物实验中心(SCXK GUI 2009-0002),随机分为空白组(20只):用于实验对照;手术组(20只):用于观察脊髓组织病理变化;功能评价组(20只):用于行为学评分。均饲养于广西医科大学标准动物实验室,室温(23±2)℃,12 h间隔照明,定期消毒和通风,自由进食消毒颗粒饲料和高压消毒后的自来水(广西医科大学动物实验中心提供)。 1.2 大鼠Allen's脊髓损伤模型的建立
手术方案:取手术组和功能评价组大鼠,采用水合氯醛0.33 mL/100 g腹腔注射麻醉,麻醉后,大鼠以俯卧位固定,对背部切口处进行剪毛,消毒,铺巾,通过摸肋骨的方法,定位T10为中心,作长约4 cm的纵行皮肤切口,依次切开各层皮下组织,暴露出T10棘突,用微型咬骨钳咬除 T10棘突及椎板,将 T10段脊髓暴露(见图1)。后采用自制改良的Allen's装置(见图2),先将一打击面直径约3.5 mm圆形薄塑料垫片置于 T10脊髓表面,再用重10 g铁锤从30 mm高处自由落下,撞击硬膜囊,造成T10段脊髓的冲击伤,撞击后以消毒温盐水清洗损伤脊髓,之后依次缝合肌肉、筋膜、皮肤。脊髓损伤模型造模成功的标志:在Allen装置撞击脊髓时,大鼠发生身体抖
动,其双下肢迅速回缩及弹动,尾巴发生翘起并迅速倒下,其打击局部脊髓表面迅速瘀血。术后应用抗生素,连续3 d肌注青霉素(广西医科大学第一附属医院药剂科提供)3万U/次,2次/d。急性脊髓损伤后,大鼠会出现暂时性自主排尿功能丧失,可采用下腹部按压膀胱法,进行人工排尿,3次/d,直至大鼠自主排尿功能恢复。
图1 T10段脊髓暴露
图2 自制改良的Allen装置
1.3 观察项目与方法
1.3.1 一般情况观察:大鼠术后严密观察进食、饮水情况,毛变化,切口愈合状态、缝线有无脱落及有无感染情况,自主排尿功能的恢复情况。
计算机仿真
1.3.2 脊髓功能评分:采用改良Rivlin斜板试验和脊髓运动功能BBB(Basso,Beattie and Bresnahan)评分法[3](共 21级)对功能评价组大鼠脊髓损伤前后的行为及后肢运动功能进行评定。分别在术前1 d,术后1 d进行,每项指标共测定3次。BBB评分者为非本实验组但熟知评分标准的人员。在评分前所有动物均检查膀胱充盈度,防止因膀胱充盈而影响活动,造成实
验误差。
1.3.3 组织取材及切片制备:术后1 d取手术组受损部位脊髓,于同一时间点取空白组大鼠相应部位脊髓组织。麻醉动物(每个时间点每组随机取10只),经左心室灌注肝素生理盐水约200 mL直至流出澄清液,再使用4%多聚甲醛约200 mL灌洗固定,取以损伤为中心的长约5 mm脊髓组织和空白组大鼠相应部位脊髓组织,用4%多聚甲醛固24 h,常规石蜡包埋,连续切片,每个样本切片 10张,片厚 5 μ m。每个样本常规HE染。
1.4 统计学处理:采用SPSS16.0统计软件包进行统计分析,各组数据均采用表示,采用两样本均数的t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 一般状况:造模术后,手术组与空白组相比,出现了下肢瘫痪和尿潴留等现象,并伴有较重的口唇炎等现象。所有大鼠术后10 d内缝线全部脱落,术中手术组发生大鼠死亡1例,即进行了补充。
2.2 行为学评分:本实验中,功能评价组的大鼠术前改良Rivlin斜板度数测得为(60.2±1.8)°,BB
B评分为 20.8±0.6。功能评价组大鼠伤后4周内双后肢功能完全丧失,肌力为0,以俯卧位行走,全部出现尿潴留,出现脊髓休克表现。术后1 d,功能评价组术前的斜板度数和BBB评分均高于功能评价组术后的斜板度数[(25.34±1.23)°]和BBB评分(0±0)(P＜0.05)。功能评价组术后的斜板度数和BBB评分比空白组斜板度数(60.8±0.5)°,BBB评分(20.6±0.2)低(P＜0.05)。
环氧树脂模具2.3 脊髓组织病理变化:HE染高倍光镜下可见,空白组脊髓组织结构清晰,无明显空腔和出血,组织无炎症细胞浸润,神经元也未出现水肿变性(图3A);手术组术后 1 d脊髓组织结构紊乱,但未见明显出血,灰质中有较多且大的空腔形成,神经细胞出现水肿和坏死,坏死情况比空白组脊髓组织严重(图 3B)。
图3 脊髓组织病理变化A:空白组脊髓前脚(HE×400) B:手术组术后1 d脊髓前脚(HE×400)
3 讨 论
创新社会管理体制
Allen的重物坠落法原理是:采用重物自由下落打击在放置于大鼠脊髓表面的垫片上,从而造出损伤模型。模型的特点是:①模拟人类脊髓受损的过程,临床相似度高[4]。②可以人为调整致伤的部位和范围[5]。③硬膜具有完整性,保证无外源性成分侵入,防止脑脊液外漏。可
以说此模型是当前与临床脊髓损伤相关性最好的造模方式。通过垂直撞击造成脊髓的水肿和缺血并造成继发性损伤。此法不切开硬膜,所以未对脊髓组织切割[6,7]。但当重物下落撞击脊髓时,由于重物不能及时移开而造成脊髓的新损伤。同时由于脊柱脊髓在打击时发生了偏移,常常造成致伤结果的不一致。而且,同样的势能造成的损伤程度也不太相同。针对此模型的不足之处,为使该模型更具有临床相关性,我们提出了改进方案:将大鼠四肢头部固定,能够减少致伤装置系统具有的变异因素。此外,设计的打击仪将重物、垫片等物件均附于一个底座上,使动物的固定与调节操作更方便、灵活,从而使该模型的稳定性和可控性都得到提高。
本实验中对大鼠SCI后运动功能的观察通过运动功能评分及病理组织切片,从主观、客观两方面评价致伤脊髓对小鼠运动功能的影响。大鼠运动功能评分采用国际通用的BBB功能评分。BBB功能评分是用于反映大鼠运动功能的一项比较客观的评分标准,可用于反映脊髓损伤的恢复情况。此法几乎包括了大鼠后肢恢复过程中所有的行为学变化,而且与脊髓损伤的程度基本相符,能够很好体现脊髓恢复过程的细节。该法的主要特点有[10]:①专门评价大鼠脊髓损伤后后肢的功能恢复。②每个分数都会有一个独立的标准。③全面包括了大鼠后肢恢复过程中所有的行为学变化。④评分按照脊髓损伤的恢复过程排列。⑤经研究表明,该标
准客观性较高,误差小。斜板试验是将大鼠放置于长方形木制斜板,上垫橡胶垫。每只老鼠测5次,取其平均值。此法简单可靠,常作为常规观察指标,但由于对鼠爪位置、鼠尾下垂或上翘等动作不能进行评价,而这几项功能又常常反映整体功能,所以可用于BBB功能评分的一项补充。在本组实验中,功能评价组术前的改良Rivlin斜板度数明显高出术后,且差异有统计学意义(P＜0.05)。从实验大鼠后肢的运动功能恢复来看,BBB评分表明:术后1 d与术前差异有统计学意义(P＜0.05)。由于本研究中观察的时间有限,1 d后是否依旧有差异,还需后续的研究探索。脊髓是由白质和灰质组成的,血管丰富且质地松散,当脊髓受打击时,灰质较白质损伤更重,而且灰质的神经细胞受损更严重。本实验HE染发现:空白组脊髓组织结构清晰,无出血和炎症细胞浸润,神经元正常;手术组脊髓组织结构紊乱,灰质中有较多空腔,神经细胞水肿坏死。结果表明在Allen装置撞击脊髓后,大鼠脊髓组织结构和病理形态发生很大的变化。
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