2022，42（2）:056
J.SHANXI AGRIC,
UNIV .（Natural Science Edition ）
学报（自然科学版）04097
路媛媛1，孙承龙2，谭玉琴1，魏文杰1，史咸春1，宋艳波1，李丽1，刘振宇3*
双榆树公园（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；
3.山西农业大学信息科学与工程学院，山西太谷030801）
摘要：［目的］通过对玉蜀黍尾孢菌VelB 基因进行生物信息学分析并构建敲除载体，为研究CzVelB 调控玉蜀黍尾孢 菌致病性的分子机制奠定基础。［方法］从JGI 数据库中获得CzVelB 基因序列，对其进行生物信息学分析，包括蛋白质的性质、保守区域、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构域和聚类分析，分析其基因功能。并采用同源互补原理构建CzVelB 基因敲除载体，最终采用农杆菌介导遗传转化技术进行基因敲除。［结果］CzVelB 基因编码385AA ，预测pI 和MW 分别为9.05和42.13645kDa ，是亲水性蛋白，无跨膜结构域。在亚细胞水平上，CzVelB 定位在细胞核中。在氨基酸序列方面，具有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点；在功能上具有2个Velevt 的保守结构域，并与As⁃pergillus flavus 、A.niger 亲缘关系较近，具有较高同源性。根据CzVelB 基因序列设计特异性引物，扩增侧翼片段和标记基因，分别连入骨架载体pPZP100中，成功构建CzVelB 基因的敲除载体，最终利用ATMT 成吉思汗论坛技术获得其敲除转化子。［结论］本文系统研究玉蜀黍尾孢菌VelB 基因功能，并成功构建其敲除载体，获得敲除转化子，为后续研究CzVelB 基因功能提供基础材料。
关键词：玉蜀黍尾孢菌；VelB ；生物信息学；敲除载体；敲除突变体中图分类号：S432.1
文献标识码：A
文章编号：1671-8151（2022）02-0056-09
玉米灰斑病是世界玉米种植区重要真菌性病害之一，其病原菌为玉蜀黍尾孢菌（Cecrospora ze⁃ae⁃maydis Tehon &Daniels ），属子囊菌门球腔菌属真菌［1］。自1991年首次在我国辽宁丹东地区发现该病害以来，玉米灰斑病菌在我国多次爆发流行，近些年在东北地区大面积发生，危害程度达3~5级，严重地块达7级，给玉米生产造成了惨重损失［2］。随后在山东、吉林、云南等地区相继发生，成为我国东北和西南玉米产区一种重要病害［3］。
病原菌致病性分化与变异是引起病害流行的主导因素之一。对病原菌进行致病性研究发现，病原菌侵染后显症速度不同，且出现的病斑类型也存在明显差异。通过血清学和蛋白质组学研究证明了病原菌存在分化现象［4］。对玉蜀黍尾孢菌致病性的研究主要集中在尾孢毒素方面。长期以
来，致病学家和化学家研究内容主要集中在尾孢毒素的分离、纯化［5］和化学结构鉴定［6］等方面。
曲靖师范学院教务网络管理系统
目前对尾孢毒素的提取仍采用浓缩浸提法［7］，研究发现该毒素对寄主保护酶及玉米胚根的生长有抑制作用，对玉米胚根细胞膜具有伤害，且能够引起叶片的电渗值发生变化［8-10］。但目前对该毒素的主要成分仍有争议［11-12］。由上可知，对玉蜀黍尾孢菌致病分子机理的研究较少。因此，尽快寻发掘相关致病基因对于摸清玉米灰斑病菌致病性分子机理，以及玉米灰斑病的防治具有重要意义。
Velvet 蛋白家族最早发现在模式真菌Asper⁃gillus nidulans 中［13］，是一类真菌特异的具有Vel⁃vet 结构域的蛋白。该家族含有VeA （Velvet ），VelB （Velvet like B ），VosA （Viability of spores A ）和VelC （Velvet like C ），具有调控真菌次生代谢及
路媛媛，孙承龙，谭玉琴，等.玉蜀黍尾孢菌VelB 基因敲除及生物信息学分析［J ］.山西农业大学学报（自然科学版），2022，42（2）：56-64.
Lu Y Y ，Sun C L ，Tan Y Q ，et al.Knockout and bioinformatics analysis of VelB gene in Cercospora zeae -maydis ［J ］.Journal of Shanxi Agricultural University （Natural Science Edition ），2022，42（2）：56-64.doi ：10.13842/jki.issn1671-8151.202111016
收稿日期：2021⁃11⁃11修回日期：2022⁃01⁃12基金项目：山西省高等学校科技创新项目（2020L0130）；山西农业大学科技创新基金项目（2018YJ30）作者简介：路媛媛（1987-），女，
副教授，博士，研究方向：病原真菌遗传学
*通信作者：
刘振宇，教授，博士生导师，E -mail ：**************
42（2）路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
生长和发育的作用。其中Vel B是Velvet家族中唯一包含2个Velvet结构域的成员［14］。近些年研究结果表明，VelB可通过调控Cochliobolus sati⁃vus、Fusarium oxysporum、Curvularia lunata等子囊菌的次生代谢产物、孢子产生及子实体的形成，最终调控致病性［15-17］。本课题组前期研究利用农杆菌介导遗传转化技术，获得玉米灰斑病菌PH6WC（强致病类型）突变体库，通过形态学和致病性分析，从突变体库中获得一个产孢量下降，致病力明显减弱的菌株，通过Tail-PCR分析，获得T-DNA插入位点为VelB基因的启动子区域［18］。
因此，本文克隆玉蜀黍尾孢菌的CzVelB基因序列，并进行生物信息学分析，研究CzVelB基因与玉蜀黍尾孢菌致病性之间的关系。构建ATMT 敲除载体，获得敲除转化子，为研究CzVelB对玉蜀黍尾孢菌致病性的分子机制奠定基础，同时也为加快该重大植物病害的防控理论研究提供新的思路和策略。
1材料和方法
1.1试验菌株、载体及试剂
本试验所用的玉米灰斑病菌菌株Cz-1，大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌为EHA105由山西农业大学生命科学学院保存，载体构建所需的pPZP100和pCT74购买于武汉淼灵生物科技有限公司。
三星p2250w
本文中所使用2×Es Taq Master Mix，所用试剂盒及抗生素等试剂购于沈阳森宇生物科技有限公司。
限制性内切酶、T4连接酶、PMD19-T Vector 购于Takara生物技术有限公司。
1.2试验方法
1.2.1生物信息学分析超声波测距仪的设计
根据NCBI基因组数据库中Colletotrichum graminicola中的VelB保守区序列，从JGI数据库中Cecrospora zeae-maydis基因组中查询到相似度较高的基因，采用DNAMAN软件对C.zeae-may⁃dis基因组中的VelB蛋白序列进行同源性比对分析，最终确定其基因序列和拷贝数。根据所得到的基因序列，利用多种生物信息学软件对CzVelB 基因的性质、结构及功能进行预测。
生物信息学分析软件如表1所示，分别对Cz⁃VelB蛋白的氨基酸组成、理化性质、疏水性、跨膜结构、磷酸化位点、亚细胞定位、保守结构域以及信号肽进行分析。在NCBI数据库中Blast搜索其他病原真菌VelB基因序列，使用MEGA5.0软件，利用NJ法构建系统发育树，Bootstrap分析重复数为1000。
1.2.2CzVelB侧翼序列的获得
首先采用CTAB法［19］对玉米灰斑病菌进行基因组DNA的提取。其次根据CzVelB序列，利用DNAMAN和BioXM软件设计特异性引物，并结合PCT74载体上标记基因序列和pPZP100骨架载体序列，在特异性引物的5'端加入酶切位点，最后利用高保真PCR技术获得侧翼序列。
引物如下，其中gcc为保护碱基，小写字母并
表1生物信息学分析工具及网址Table1Bioinformatics analysis tools and websites
软件/工具
Software/Tools
ProtScale（https：///protscale/）
Protparam（https：// /cgi-bin/protparam/）Genescan（http：//hollywood.mit.edu/GENSCAN.html）TMPRED（https：///resources/tmpred）SignalP⁃4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP⁃4.1/）NetPhos3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）WoLF PSORT Prediction（https：//wolfpsort.hgc.jp/）
NCBI（https：//bi.v/Structure/i）
分析
Analysis
疏水性分析
基础蛋白质理化性质
氨基酸组成分析
蛋白质跨膜区域
蛋白质信号肽
蛋白质磷酸位点
蛋白质亚细胞定位
蛋白保守结构域预测
57
2022山西农业大学学报（自然科学版）
修伟良带有下划线为酶切位点碱基。
CzVelB-5F-F1：gccgtcgacTGTGTACCC⁃GACCTCAGTG
CzVelB-5F-F2：gcctctagaTTCCATAAATC⁃GACCGTGAG
HphGFP-F：gcctctagaCAATTAACCCT⁃CACTAAAGG
HphGFP-R：gccggtaccTAATACGACT⁃CACTATAGGG
CzVelB-3R-R1：gccggtaccTCAACCTC⁃GTCCGTCATTCG
CzVelB-3R-R2：gccgagctcAGGT⁃GACAAATTAGGCGCTT
高保真PCR反应体系：DNA1.0μL，5×Phu⁃sion HF10.0μL，dNTP mixture（10mM）1.0μL，primer（10µM）2.5μL，最终ddH2O定容至50.0μL。
PCR反应程序：98℃，30s；98℃，10s；Tm，30 s；72℃，30s共30个循环；72℃，10min；4℃，保存。
1.2.3CzVelB敲除载体构建及验证
以野生菌Cz-1为模板，分别采用CzVelB-5F-F1/CzVelB-5F-F2、CzVelB-3R-R1/CzVelB-3R-R2和HphGFP-F/HphGFP-R扩增上游、下游和标记基因片段，扩增产物连入pMD19-T载体，大肠杆菌转化后，用质粒试剂盒提取质粒，酶切验证。上游片段和pPZP100经SalⅠ和XbaⅠ酶切后连入，构成重组质粒pPZP100CzVelB-5F。随后用KpnⅠ和SacⅠ酶切下游片段和重组质粒pPZP100CzVelB-5F，构成重组质粒pPZP100Cz⁃VelB-5F3R，最后分别采用Hind IIⅠ和KpnⅠ酶切重组质粒pPZP100CzVelB-5F3R和标记基因片段，形成敲除载体质粒pPZP100HphGFP-Cz⁃VelB（图1）。
1.2.4CzVelB敲除突变体获得及验证
将上述构建好的敲除载体质粒pPZP100Hph⁃GFP-CzVelB，利用冻融法转化到农杆菌感受态EHA105细胞中［18］。将疑似含有敲除载体质粒pPZP100HphGFP-CzVelB的农杆菌，置于28℃培养至菌液浑浊，随后进行PCR验证。
通过农杆菌介导的方法，将含有敲除载体的农杆菌转化到玉蜀黍尾孢菌基因组中，获得敲除
突变体［19］。将转化所得拟敲除突变株进行单胞分离，继代培养后，取长势较好的疑似转化子接种在250µg·mL-1头孢霉素、200µg·mL-1潮霉素的PDA 培养基中进行验证。随后提取疑似转化子DNA，最终利用PCR的方法进行验证。
2结果与分析
2.1CzVelB基因序列的获得
根据NCBI中Colletotrichum graminicola中的VelB保守区序列（XM_008095148.1），利用JGI数据库中Cecrospora zeae-maydis基因组序列，分析获得1个相似度高达95%的VelB基因，将该基因定为CzVelB。该基因全长为1184bp。
2.2CzVelB生物信息学分析
2.2.1CzVelB的蛋白质组成及理化性质
利用DNAMAN对CzVelB编码的氨基酸组成进行分析，结果表明该基因编码氨基酸为385个，含有一个开放阅读框。蛋白序列如图2所示。
利用ProtParam对CzVelB编码的氨基酸进行理化性质分析，结果表明该蛋白42.13645kDa，等电点（
PI）为9.05，正（Asp+Glu）/负（Arg+Lys）的电荷残基数分别为31和26，分子式为C1884H2887N519
O561S11，总原子数为5862，不稳定性指数值为58.27（<40稳定；>40不稳定［20］），因此该蛋白属于不稳定蛋白，脂肪指数为67.90，总平均亲水性是−0.434，为亲水性蛋白。
2.2.2CzVelB蛋白的亲水性/疏水性分析
利用ProtScale对CzVelB蛋白亲/
疏水性进行图1敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelB
Fig.1Delection vector pPZP100HphGFP-CzVelB
58
42（2）路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB 基因敲除及生物信息学分析预测分析，结果如图3所示。CzVelB 蛋白在第268位氨基酸上得分为1.15，有最强疏水性；而在第12位上亲水性最强，最低值为−2.10。玉米灰斑病CzVelB 蛋白的亲水性总平均值为−0.434，表明该蛋白为亲水性蛋白。2.2.3
CzVelB 蛋白跨膜结构域分析
利用TMPRED 对CzVelB 蛋白的跨膜结构域进行预测分析（图4）。得分越高，则说明该蛋白质位于某一部位的概率就越大。根据预测结果可知
该蛋白处于膜外，没有跨膜结构区。2.2.4
CzVelB 蛋白磷酸化位点分析
磷酸化多数情况下是发生在丝氨酸（Serine ，Ser ）、苏氨酸（Threoine ，Thr ）、酪氨酸（Tyrosin
e.Tyr ）等氨基酸的残基上。利用NetPhos 3.1在线软件在线分析CzVelB 蛋白的磷酸化位点，结果如图5所示。发现在该蛋白上存在有17个丝氨酸激酶磷酸化位点（第21、44、146、149、157、158、169、200、274、285、298、307、323、346、356、365、372
位
图2CzVelB 基因碱基序列及氨基酸序列
Fig.2
Gene and amino acid sequence of CzVelB gene
59
2022
山西农业大学学报（自然科学版）氨基酸）、5个苏氨酸激酶磷酸化位点（第97、111、
122、137、280位氨基酸）以及7个酪氨酸激酶磷酸化位点（第82、172、202、206、221、283和360位氨基酸）。该结果说明，CzVelB 能够被激酶磷酸化，从而实现其功能的调控。
2.2.5CzVelB 蛋白的亚细胞定位
采用PSORT 对玉米灰斑病CzVelB 的亚细胞定位进行预测，结果显示：CzVelB 在细胞核（nucle⁃ar ）、细胞质（cytoplasmic ）、线粒体（mitochondrial ）、过氧化物酶（peroxisome ）、高尔基体（Golgi appara⁃tus ）的分布比例分别为15.5%、7.5%、2%、1%、1%，说明CzVelB 蛋白定位在细胞核中。
2.2.6CzVelB 蛋白功能结构域
利用NCBI 对CzVelB 蛋白进行蛋白质结构域分析（图6）。其氨基酸序列含有2个Velvet 结构域，具有Velvet 蛋白的典型特征。
2.2.7CzVelB 蛋白信号肽分析
利用软件SignalP -4.1预测玉米灰斑病Cz⁃VelB 编码蛋白信号肽。C -score 、S -score 、Y -score 分别代表着剪切位点的得分、信号肽的得分和综合酶切位点的得分。信号肽预测结果计算方式为以上3个值均为最大值的位点才是可信度最高的信号肽剪切位点，由图7可知得出该蛋白不存在信号肽位点，目前可以推测该蛋白为非分泌蛋白。2.2.8
CzVelB 系统进化分析
结合GenBank 和JGI 数据库中Curvularia lu⁃
nata 等多种植物病原菌的VelB 保守区序列，利用MEGA5对CzVelB 进行系统进化分析（图8）。A.flavus 、A.niger 、Cecrospora zeae -maydis 、Emeri⁃cella nidulans 聚为一类，Curvularia lunata 、Collet⁃otrichum graminicola 和Cochliobolus heterostro⁃phus 聚为一类，其中Cecrospora zeae -maydis 与A.flavus 、A.niger 亲缘关系较近。CzVelB 的同源性分析进一步验证了该基因具有保守性。即推测出的CzVelB 功能与A.flavus 、A.niger 的VelB 基因功能相似，
参与调控玉蜀黍尾孢菌致病性。
图3CzVelB 蛋白的疏水性和亲水性分析
Fig.3
Hydrophobic and hydrophilic analysis of
CzVelB
图4CzVelB 蛋白质跨膜结构域分析Fig.4
Transmembrane analysis of
CzVelB
图5CzVelB 蛋白磷酸化位点分析
Fig.5
Phosphorylation sites analysis of
CzVelB
图6
CzVelB 蛋白结构域分析
Fig.6
Conserved domain analysis of CzVelB
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