三氯杀螨醇对雄性黑斑蛙的毒性效应研究

第32卷第3期扬州大学学报(农业与生命科学版)Vol.32No.32011年9月Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)Sep.2011
三氯杀螨醇对雄性黑斑蛙的毒性效应研究
黄敏毅1,季晓丽1,段仁燕1,张 欣1,董佳佳2
(1.安庆师范学院生命科学学院,安徽安庆246011;2.陕西师范大学生命科学学院,陕西西安710062)
摘 要:分别用不同剂量的三氯杀螨醇对雄性黑斑蛙(Rana nigromaculata)成体隔日进行腹部淋巴囊注射,处理7d后观察各处理组黑斑蛙精子活力、形态,统计精子总数和精子畸形率。结果表明:随着三氯杀螨醇浓度的增大,黑斑蛙精子活力下降,总数减少,畸形率明显增加,说明三氯杀螨醇对雄性黑斑蛙成体生殖能力具有明显的毒性效应。
关键词:三氯杀螨醇;黑斑蛙;毒性效应
中图分类号:Q 958     文献标志码:A       文章编号:1671-4652(2011)03-0070-04
Toxic effect of dicofol on male Rana nigromaculata
HUANG Min-yi 1,JI Xiao-li 1,DUAN Ren-yan1,ZHANG Xin1,DONG Jia-jia2
(1.Sch of Life Sci,Anqing Teach Coll,Anqing 246011,China;
2.Coll of Life Sci,Shanxi Norm Univ,Xi’an 710062,China)
ABSTRACT:Male Rana nigromaculata were injected in ventral lymph follicle in different doses of dicofol solution every aday.After 7days,the sperm activation,sperm deformity,number and abnormal ratio were observed and calculated.Theresults showed that with the dicofol concentration increasing,sperm activation 
reduced,sperm number decreased,andsperm abnormality rate increased significantly.The results showed that dicofol has toxic effects on male R.nigromaculatareproduction obviously.
KEY WORDS:dicofol;Rana nigromaculata;toxic effect
三氯杀螨醇(DCF)是以滴滴涕(DDT)为原料合成的一种有机氯杀螨剂。近年来,越来越多的研究表明,DCF在环境中残留,对野生动物和人类具有较强的毒性、雌激素效应及致畸、致癌、致突变作用[1]。有关DCF对环境影响的研究,主要集中在蔬菜、果品等食品中残留及降解动态,以及其对动物神经系统、生长发育、内分泌及致癌性等方面研究,如DCF可影响鲤鱼体内性激素的合成和代谢[2]、诱导大鼠肝细胞素P450的表达[3]、促进人类乳癌细胞(MCF7)增殖[4]、影响大型溞(Daphnia magna)的生长发育[5]等。目前尚未见其对雄性黑斑蛙毒性影响的研究。
据报道,全球范围内两栖类动物种数量急剧下降[6],其影响因素是多方面的,两栖动物由于其
皮肤的高渗透性、水陆两栖等生物学特性,对环境污染极其敏感,农药是其主要影响因素之一[7-8]。黑斑蛙(Rana nigromaculata)是我国农林地区的广布种,对农田和林木具有重要的生物防治作用。DCF可通过多种途径排放进入水体中,对两栖动物的生境造成威胁,为评价DCF对两栖动物的毒性效应,本试验对黑斑蛙成体进行染毒,观察和统计其精子活力、精子总数和精子畸形率,探究DCF对黑斑蛙的毒性机制,以期用DCF对两栖动物的影响做出更为准确的评价,为保护两栖动物和其他水生生物奠定基础,这将对两栖动物的生态保护及种数量的恢复具有重要的意义。
收稿日期:2010-07-23
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金资助项目(KJ2010B092);安庆师范学院青年基金资助项目(KJ201118)
作者简介:黄敏毅(1979- ),女,广西梧州人,安庆师范学院讲师、硕士,主要从事环境毒理学研究。
E-mail:huang.m.y@163.com
1 材料与方法
1.1 供试动物
试验用黑斑蛙成体采自安庆市大龙山附近农田,运回实验室后,放置于盛有预先曝气的自来水水族缸(53.5cm×39.0cm×29.0cm)内,自然光照下饲养3d后,挑选体格健壮、个体大小相似的雄蛙进行染毒处理,体重为(36.2±1.5)g
。试验期间禁食。1.2 仪器和药品
染毒试剂为三氯杀螨醇(分析纯,纯度99%,德国Sigma-Aldrich公司),用0.5%无水乙醇溶解,分别配制成浓度为200和400mg
·L-1的三氯杀螨醇母液,备用。Olympus显微镜为日本Olymp
us公司生产;电子天平(FA2004A)为上海精天电子公司生产,精度0.001g;血球计数板为江苏丹阳市健陵医疗器械公司生产;其他试剂为0.65%任氏液、
苏木精和伊红染料。
1.3 试验方法
将黑斑蛙随机分成4组(其中3组为加药组、1组为对照组)
,每组6只,同时设相应的平行组。加药组注射剂量分别为2、4和8mg·kg-1,采用腹部淋巴囊注射[9]
,隔日注射1次,
共注射3次,最后1次注射2d后采用双毁髓处死,
剖腹取精巢。为了保持黑斑蛙生活环境的清洁,隔日换水1次。另设1个相应的对照组,注射与加药组等体积的0.5%无水乙醇。
分别取各组黑斑蛙一侧精巢,将其放入1mL任氏液中,
用镊子将其充分捏碎,让精子完全流出,稀释后,取精子稀释液,滴于诺氏血球计数板上,静置5min
,按常规方法进行精子计数[10]
,用高倍镜观察精子活力、
活动时间和精子尾部摆动频率。精子活力是指给定视野中运动精子数占精子总数的百分比;活动时间
是指从精子运动至90%精子原地颤动为止的时间;精子尾部摆动频率是指精子尾部每分钟摆动的次数。
显微镜下观察精子形态,记录精子畸形情况。随机观察各组每只蛙精子涂片的500个完整精子,求出平均值,计算畸形率,Olymp
us显微镜下观察。1.4 数据分析
采用SPSS13.0统计软件分析数据,
组间比较采用单因素方差分析。2 结果与分析
2.1 黑斑蛙成体染毒后的症状随着三氯杀螨醇浓度的增大,黑斑蛙吻部和皮肤出现的红肿溃烂现象就越明显。第1、2次注射后,
8mg·kg-1组黑斑蛙不断用头撞击水族箱,出现吻部和身体皮肤溃烂;第3次注射后,8mg·kg-1组黑
斑蛙活力明显减弱,动作缓慢,反应迟钝,且吻部皮肤出现红肿溃烂现象,明显比2、4mg·kg-1
组吻部
皮肤溃烂严重。为什么植树是义务
2.2 三氯杀螨醇对黑斑蛙精子活力和精子总数的影响
与对照组相比,2mg·kg-1组精子活力和活动时间变化不太明显,4、8mg·kg-1
组黑斑蛙精子活动时间减少(图1),同时活力明显减弱(图2)。经回归分析可知,处理后黑斑蛙精子总数(y)
与三氯杀螨醇浓度(x)呈显著负相关,回归方程为y=-201.63x+1 345.6(R2=0.96*
),即浓度越高,黑斑蛙精子总数减少越明显(图3)。与对照组相比,随着三氯杀螨醇浓度的升高,4、8mg·kg-1
组精子尾部摆
动频率明显下降(图4
。2.3 三氯杀螨醇对黑斑蛙精子形态的影响
显微镜观察可见,对照组黑斑蛙精子头部呈棒状,较直且粗,头部长(9.93±0.13)μm、宽(1.35±0.18)μm;细胞核染为蓝紫,位于头部顶体后侧;头部后为一条长长的尾,长(30.46±0.54)μm。油镜下可见精子顶体呈囊状覆盖于头部顶端,中片呈漏斗状包裹头部底端,尾部细长,头尾直径相差较大,
头部一般宽于尾部3倍。1
7第3期
黄敏毅等:三氯杀螨醇对雄性黑斑蛙的毒性效应研究
图1 三氯杀螨醇对黑斑蛙精子活动时间的影响
Fig.1 Effect of dicofol on the sp
ermactive time in R.nig
romaculata*不同字母间表示差异显著(
P<0.05)图2 三氯杀螨醇对黑斑蛙精子活力的影响
Fig.2 Effect of dicofol on the sp
ermactivity 
in R.nigromaculata*不同字母间表示差异显著(
P<0.05
)图3 三氯杀螨醇对黑斑蛙精子总数的影响
Fig.3 Effect of dicofol on the sp
ermnumber in R.nig
romaculata*不同字母间表示差异显著(
P<0.05)图4 三氯杀螨醇对黑斑蛙精子尾部摆动频率的影响
Fig.4 Effect of dicofol on the sp
erm tailswing frequency 
in R.nigromaculata*不同字母间表示差异显著(
P<0.05)  由表1可知,
中小企业erp>tmis用三氯杀螨醇处理后黑斑蛙精子出现明显的畸形。畸形现象表现为:①短头形,与对照相比头部明显变短;②胖头形,与对照组相比,精子头部肥大,甚至呈椭圆形;③弯曲形,精子头部出现弯曲,但弯曲幅度较小,呈“L”
形弯曲;④圆圈形,精子头部弯曲幅度较大,头部呈圆圈形。表1 各浓度组黑斑蛙不同形态精子畸形率*
Tab.1 Sperm deformity 
ratio of R.nigromaculatain different doses of dicofol浓度/mg·kg
-1样本数短头形/%
胖头形/%
弯曲形/%
圆圈形/%
0(
对照)500 0.74a
±0.14 0.86a
±0.18 0.83a
±0.21 0.62a
±0.092 500 1.57b±0.24 2.12b±0.31 1.99b±0.13 2.12b±0.164 500 2.14c±0.17 2.28b±0.13 2.51c±0.23 2.14b±0.208 
500 
2.23d±0.27 
3.12c±0.27 
2.67c±0.19 
3.12c±0.16
   *同列不同字母数值间差异显著(
P<0.05)。由图5可见,随着三氯杀螨醇浓度的升高,黑斑蛙精子畸形率明显增大,经回归分
析可知,处理后黑
斑蛙精子畸形率(y)
颐和园教学设计与浓度(x)呈显著正相关,拟合直线方程为y=0.033 5x+0.010 2(R2=0.91*
),即三氯杀螨醇浓度越高,各处理组黑斑蛙精子畸形率明显升高。
3 小结与讨论黄集骧
3.1 三氯杀螨醇对黑斑蛙成体行为的影响
三氯杀螨醇对黑斑蛙活力具有一定的影响,随着三氯杀螨醇浓度的增加,黑斑蛙活力明显降低。对
大鼠研究表明,三氯杀螨醇具有神经毒性作用[11-
12]。本试验染毒组黑斑蛙不断用头部撞击水族箱,推测
三氯杀螨醇可能导致黑斑蛙的神经受损;也可能是三氯杀螨醇对黑斑蛙皮肤有刺激作用,从而引起吻部
7扬州大学学报(农业与生命科学版)
第32卷
图5 各浓度组黑斑蛙精子的畸形率*Fig.5 Sperm deformity 
ratio ofR.nig
romaculatain different doses of dicofol*不同字母间表示差异显著(
P<0.05)皮肤出现溃烂。究竟是何种原因引起黑斑蛙吻部皮肤溃
烂,尚需进一步研究。3.2 三氯杀螨醇对黑斑蛙精子的毒性效应
运动能力是保证精子在受精过程中与卵细胞相遇,并完成对卵膜的机械穿透作用,也是精子诸多功能综合直观
windowblinds 6
表现。Perobelli等[1
3]
用三氯杀螨醇处理大鼠,染毒大鼠精子活力明显下降。本试验结果表明,用三氯杀螨醇处理黑斑蛙,其精子活力降低,这与Perobelli等[1
3]研究结果相似,说明三氯杀螨醇对黑斑蛙精子活力具有一定的影响。
精子分析是评价雄性繁殖力最常用的方法,精子质量(如精子形态、畸形率和精子数等)变化可反映早期的生殖损害,精子畸形率可作为三氯杀螨醇对精子遗传物质潜在
性影响的间接指标。Jadaramkunti等[1
4]
研究发现三氯杀螨醇对大白鼠睾丸具有毒性作用,表现在高剂量的三氯杀螨醇可导致大白鼠精巢中生精小管管腔变小
及小管内生精细胞数减少。本试验结果表明,随着三氯杀螨醇浓度的增加,黑斑蛙精子总数减少,精子畸形率增加,
说明三氯杀螨醇可对黑斑蛙生精功能造成损害,影响黑斑蛙精子的发生,从而影响精子与卵细胞结合能力,最终影响到黑斑蛙种的发展。三氯杀螨醇具有雌激素效应[15-
16],对黑斑蛙精子发生具有明显的影响,其原因可能是直接或间接作用于动物下丘脑-垂体-精巢轴,或影响黑斑蛙体内的雄
激素水平,这尚待进一步研究。参考文献:
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