105
小肽，通常指5～60个氨基酸组成的肽段，但在植物中也把长度少于100个氨基酸的肽段归为小肽[1]。自1991年科学家在番茄中发现长为18个氨基酸的系统素参与病虫害引起的植物抗虫反应以来[2]，已经发现并报道了几十个家族的植物小肽参与基因表达调控，而且它们也参与发育和抗病等生物学过程。小肽主要作为信号分子起作用，由此又被称为“小肽激素”。与传统植物激素一样，小肽激素起作用的浓度很低，有些小肽甚至可以在飞摩尔浓度(fmol, 1 fmol/L=10-15mol/L)下起作用。 根据其N 端序列不同，植物小肽可分为分泌型小肽和非分泌型小肽。非分泌型小肽主要在细胞内发挥功能，而分泌型小肽在胞内合成后运送到胞外，甚至通过木质部和韧皮部运输到其他组织器官，介导细胞间通信[3]。分泌型小肽可分为富含半胱氨酸小肽(cysteine-rich peptides, CRPs)和翻译后修饰小肽。多种CRPs 被发现参与到植物生殖发育的各个过程，其中包括花粉 分泌的PSK 小肽调控花粉萌发[4]，柱头分泌的STIG 小肽参与烟草花粉与柱头识别过程[5]，助细胞分泌的LURE 小肽、XIUQIU 和ZmEA1调控花粉管导向生长[6-8]，等等。植物的雌雄互作过程复杂，参与因子很多(图1)。本文主要对几种在植物花粉和柱头识别过程中起作用的小肽家族的研究进展展开介绍和讨论。 1 RALF家族
快速碱化因子(RAPID ALKALINIZATION FACTOR, RALF)最早在烟草(Nicotiana tabacum )中由Pearce 等人发现并分离得到。这类小肽可以迅速强烈地升高烟草细胞悬液培养基的pH 值，而且这类小肽在番茄中的同源基因可以抑制番茄与拟南芥幼苗的根长[9]。RALF 小肽广泛存在于植物界中，在地钱、小立碗藓、拟南芥、番茄、玉米、水稻、苜蓿、草莓等几十种植物中均发现了RALF 家族的同源基因[10-12]。目前已知，
* 国家重点研发计划项目(2018YFE0194)† 共同第一作者
雷州市第二中学†† 通信作者，研究方向：植物受体激酶调控植物发育的分子机理。E-mail:************.edu
doi: 10.3969/j.issn.0253-9608.2021.02.004
小肽激素调控植物生殖发育的研究进展
*
孙翔†，程丽军†，刘志文，李超††
华东师范大学 生命科学学院，上海 200241
摘要 近30年来，长度为几十个氨基酸的植物小肽激素被发现广泛参与到植物生长发育过程的调控。小肽激素在极低浓度下起作用，主要介导相邻细胞间通信。在植物生殖发育过程中，雌性器官和雄性器官之间存在复杂的相互作用过程，很多种小肽被发现参与到雌雄互作过程中。文章对柱头和花粉互作过程中的一些小肽家族的功能、信号转导途径和进化等研究进展加以介绍。
关键词 植物小肽；生殖发育；雌雄互作；信号转导
拟南芥中RALF家族至少有37个同源基因，这些RALF小肽在植物的生长、抗逆、胁迫响应以及生殖发育等不同生理活动中起到重要的调控作用。
1.1 RALF家族保守结构域分析
在分类上，RALF属于CRPs小肽[3]。RALF 小肽合成后分泌到胞外，作为信号分子调控自身细胞或邻近细胞的生理活动。从结构上看，RALF小肽前体由N端信号肽、中间可变区以及C端保守区组成。有些RALF小肽的可变区下游具有保守的氨基酸序列RRXL模序，其中X 代表任意氨基酸。RRXL模序可以被S1P (SITE-1 PROTEASE)识别。在拟南芥中，S1P识别RALF23并对其进行剪切，剪切后的C端即为成熟的RALF小肽[13]。目前这类含有RRXL模序的小肽研究得比较多。另一个保守模序YISY在RRXL的下游，通常被认为是RALF小肽与受体结合的位点[14]。成熟RALF小肽包含4个保守的半胱氨酸残基，这些半胱氨酸之间形成的二硫键可以帮助小肽正确折叠，二硫键被破坏则导致RALF小肽失
去生理活性[9]。对拟南芥RALF8蛋白结构解析发现其空间结构在整体上呈现无序状态，但局部存在两个有序的环状结构，且每一个环都被一个二硫键连接[15]。
1.2 RALF家族和Cr RLK1L受体家族
作为信号分子，RALF小肽与其受体的互作识别备受关注。目前已知长春花类受体激酶家族(Catharanthus roseus receptor-like kinase 1-like, Cr RLK1L)和RALF小肽家族存在受体配体识别关系。Cr RLK1L家族在拟南芥中有17个成员，其中研究最为清楚的是FER(FERONIA)受体激酶。FER定位于细胞质膜，由包含两个串联Malectin域的胞外区、跨膜区和胞内激酶区组成。FER与其共受体LRE(LORELEI)/ LLG1 (LORELEI-like glycosylphosphatidyl-inositol-anchor protein 1)相互作用，共同识别小肽RALF[16-17]。研究发现，FER胞外域识别RALF1和RALF23的信号[17-18]，而RALF23的YISY模序对于该过程是必需的[17]。除了FER以外，Cr RLK1L家族的ANXUR1/2(ANX1/2)和BUPS1/2 l/2(Buddha’s paper seal)受体激酶可以识别来自花粉中RALF4/19和柱头中RALF34的信号[19]，而THESEUS1(THE1)也是RALF34的受体之一
[20]。
图1 植物生殖发育过程中的小肽激素
106
107
1.3 RALF4/19与花粉管极性生长
RALF4在花粉中高表达，体外施加RALF4抑制花粉管萌发[21]。ralf4 ralf19双敲除突变体(ralf4/19)和RNAi 突变体表现出与anx1/2和bups1/2双突变体相似的角果变短和雄性不育表型，其花粉管体外萌发后立即破裂，在柱头表面或者刚刚进入柱头处破裂[19]。蛋白互作实验表明RALF4/19与ANX1/2-BUPS1/2互作。在极性生长的花粉管顶端，ANX1/2-BUPS1/2复合体感知自身分泌的RALF4/19信号，进而调控花粉管细胞壁的完整性[19]。此外，LLG1同源基因LLG2/3双突变体也呈现出与ralf4/19突变体花粉管相似的生长缺陷，并且表现出胼胝质沉积减少、异常膨大处酸化果胶累积、顶端甲酯化果胶增多的表型。RALF4/19的N 端和C 端分别与ANX1/2-BUPS1/2和LLG2/3结合，可以促进LLG2/3-ANX1/2-BUPS1/2的互作，RALF4/19也可以增强LLG2/3与ANX1/2-BUPS1/2之间的结合[22]。LLG2/3作为ANX1/2-BUPS1/2的伴侣蛋白协助其从内质网向细胞质膜的转运，并作为共受体在质膜上感知RALF4/19[22-23]。
花粉管特异表达的NADPH 氧化酶RBOHH/J 激发活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，进而维持花粉管的正常生长[24]；而ROS 抑制剂处理则抑制花粉管的生长，并促进花粉管破裂。LLG2/3-R
NAi 突变体中，ROS 水平显著下降，而外源施加H 2O 2可以回复LLG2/3-RNAi 中花粉管的长度与破裂率的异常表型。此外，施加RALF4可以提高花粉管中ROS 的含量。RALF4/19-LLG2/3-ANX1/2-BUPS1/2通过促进ROS 的产生，进而调控花粉管的发育[23]。
花粉管自身分泌的伸展蛋白(LEUCINE-RICH REPEAT EXTENSIN, LRX)LRX8-11在拟南芥花粉中高表达，并调控花粉管的发育[25]。晶体结构解析发现，RALF4可以直接与LRX 互作，其4个半胱氨酸所形成的空间结构对于与LRX 蛋白结合具有重要作用。LRX 单体的LRR 核心区域可以结合一个RALF4小肽，LRX 单体通过形成二聚体而起作用。另外，RALF4依赖于不同甲氨基阿维菌素
的机制结合LRX 和LLG1[26]。这些结果对于彻底解析RALF4调控花粉管生长的机制具有重要意义。
1.4 RALF34与花粉管破裂
在生殖器官中RALF34主要在成熟的胚珠中表达，尤其是在珠孔和助细胞附近高表达。RALF34处理体外生长花粉管造成其快速破裂，但是ralf34突变体花粉管体内生长表型不明显[19]。生化实验表明，RALF34竞争RALF4/19与ANX1/2-BUPS1/2的结合。当花粉管抵达胚囊处，由雌性组织分泌的RALF34可以和花粉管自身的RALF4/19竞争而与ANX1/2-BUPS1/2结合，进而造成花粉管破裂和精子释放以完成双受精[19]。
除了在生殖器官中，RALF34也在根部高表达，调控中柱鞘细胞的细胞分裂而影响侧根发生[27]。RALF34被证明可以被CrRLK1L 家族的THE1受体激酶识别而调控侧根的发生[20]。除了RALF4、RALF19和RALF34，仍有多个RALF 在雌雄生殖器官中高表达，它们的功能有待进一步阐明。
n-二甲基亚硝胺2 PCP家族与花粉水合
精准的植物雌性和雄性器官之间的相互作用对植物的生殖发育至关重要，花粉与柱头之间的信号交流是雌雄互作的第一道门。被子植物根据其柱头表面是否有分泌物分为干柱头和湿柱头[28-29]。茄科植物，如烟草和矮牵牛等具有湿柱头；十字花科植物，如拟南芥和甘蓝等具有干柱头。湿柱头对花粉的捕获不具特异性，花粉在湿柱头上的水合是被动的，而干柱头捕获花粉存在严格种间差异，且花粉的水合受到精细的调控[30-31]。
花粉外被由脂质、蛋白质、多糖和素组成，其对花粉的黏附、水合以及识别至关重要[32]。花粉外被PCP-As (pollen coat proteins class A)小肽基因家族最早从甘蓝中被鉴定[33]，其与S 基因座糖蛋白(S locus glycoprotein, SLG)互作[34]，被认为可能参与自交不亲和系统中花粉与柱头之间的相互作用，其分子机制尚不清楚。在甘蓝花粉中也
鉴定到另一个富含半胱氨酸小肽PCP-Bs (pollen coat proteinsclass B)基因家族，其参与亲和性花粉的水合调控[35-36]。PCP-Bs广泛地存在于被子植物中，在拟南芥和几种芸薹属植物中共有46个相似序
列，而且进化分析发现这些蛋白序列在家族间存在高度多态性，分为独立的PCP-B和ESF1 (embryo surrounding factor 1)两支，其中PCP-B家族在花粉中特异性地高表达。
拟南芥中鉴定出4个花粉高表达的PCP-B：AtPCP-Bα、AtPCP-Bβ、AtPCP-Bγ和AtPCP-Bδ。PCP-Bs单突变体和多重突变体花粉没有明显形态异常，其中AtPCP-Bγ单突变及多重突变体花粉水合速率相比野生型明显变慢，花粉管体内生长延迟[36]。这些突变体的花粉在高湿环境下仍能水合，说明PCP-B的缺失不影响花粉的吸水能力。pcp-b突变体在授粉后出现了各种异常，但其种子数量与野生型没有显著差异，表明PCP-B蛋白在授粉后的启始阶段起作用。因此，PCP-B是目前发现的花粉中影响柱头识别的小肽家族，推测其可能被柱头上存在的受体识别，进而开启柱头亲和性响应机制，促使花粉水合萌发[35]。对于PCP-B小肽的信号转导途径的研究将对柱头花粉识别过程的解析有重要意义。
3 SP11/SCR小肽与自交不亲和
自交不亲和(self-incompatibility, SI)是植物在繁殖过程中的一个重要调控系统，自然界约一半的开花植物使用这一系统阻止自身花粉受精繁殖[37]。植物通过这个系统在柱头表面识别并拒绝自身花粉以调节有害突变基因的积累[38]。自交不亲和系统在开花植物的不同科属中独立发展，一般可分为配子体自交不亲和与孢子体自交不亲和两种系统。在孢子体系统中，花粉的特性是由亲本的二倍体基因组决定的，目前主要研究来源于芸苔属十字花科植物，其最主要的机制由具有高度多态性的S基因座(S-Lo
cus)中的小肽SP11/SCR (S locus protein 11/S locus cysteine-rich)和受体激酶SRK (S locus receptor kinase)的识别与结合引起[39-40]。
SP11/SCR在花药中特异性表达，编码一个PCP-A1 (protein 1 of class A pollen coat protein)类的富含半胱氨酸小肽。SP11是从白菜型油菜(Brassica rapa) S9单倍型中SLG/SRK侧翼区被鉴定出[41]的，而SCR是从白菜型油菜S8单倍型中对应区域鉴定出的。研究表明，SP11以S单倍型的方式在乳突细胞中引起SI反应，即在小肽实验中只有当其被施加到相同S单倍型的乳突细胞时才会观察到这种反应，从而抑制了交叉花粉的水合作用[42]。在S基因座中有两个柱头特异表达的基因，S位点糖蛋白基因SLG(S locus glycoprotein)和S位点受体激酶基因SRK，两者均定位于柱头乳突细胞的细胞膜上，呈现高度的多态性，并且SRK是雌性自交不亲和的唯一决定性因素[43-44]。
在SI反应过程中，与SRK蛋白相同单倍型的SP11/SCR蛋白被特异性识别并结合，由此激活SRK胞内激酶活性，传递SI信号，促使柱头乳突细胞产生一系列生理生化变化，阻止花粉的水合等必要过程。在B. rapa中，乳突细胞上的SRK结合SP11/SCR后，受体激酶寡聚化，其胞内激酶区相互磷酸化从而被激活[45]。晶体结构研究显示，SCR9结合诱导eSRK9(SRK胞外结构域)同源二聚化，形成eSRK:SCR(2:2)四聚体。eSRK9通过三个高度可变(hyper-variable, hv)区域特异性识别SCR9。每个SCR9同时结合两个hv：来自第一个eSRK9单体的hvI以及来自第一个eSRK9的hvII的一半和第二个eSRK9的hvII的另一半[46]。自交不亲和信号通路的体外实验显示：在与SP11/SCR 小肽结合前，SRK
的激酶活性被硫氧还蛋白H类(thioredoxin-h-like, THL)-1/2抑制；当与小肽结合后，SRK与THL1/2分离，激酶被激活，其下游的信号通路被开启[47]。目前已知的SCR-SRK介导的自交不亲和信号通路中的信号分子尚少，还有待于进一步的遗传学发现。
4 LURE小肽和XIUQIU小肽与花粉管导向
传粉是被子植物生殖过程中的重要环节。高度协调的雌雄相互作用和信号转导作为物种特异性屏障以避免近亲繁殖和异种杂交。在亲
108
109
和性授粉中，携带两个精细胞的花粉管穿过雌蕊传输道，被精确地引导到胚珠，将精细胞释放到胚囊中完成受精[48]。在夏堇和拟南芥中发现，位于卵细胞一侧的两个助细胞分泌一种扩散的物种特异性的信号来吸引花粉管，即一种分泌型富含半胱氨酸多肽(CRPs)——LURE 小肽[49-50]。进一步的研究发现，拟南芥花粉特异性受体激酶 PRK6 (pollen-specific receptor-like kinase 6)和其同源基因是AtLU
RE1的受体，其突变体无法响应AtLURE1小肽引导的花粉管转向。AtLURE1引起PRK6在花粉管顶端的不对称分布，并通过ROPGEF12和细胞质激酶LIP1/2传递信号，调控花粉管导向型生长[6]。同时期的另一工作发现，MDIS1-MIK 受体激酶复合体也可以感受LURE1小肽，该复合体包含MDIS1 (MALE DISCOVERER1)、MIK1 (MDIS1-INTERACTING RECEPTOR LIKE KINASE1)和MIK2三种富含亮氨酸重复序列的受体激酶。MIK1-MDIS 突变体的花粉管在珠孔附近间或出现分支现象，并且受精率下降。LURE1小肽增强MDIS1与MIK1互作，诱导MIK1形成二聚体并自磷酸化，然后进一步激活MDIS1。把MDIS1转化到荠菜(Capsella rubella )中可以显著提高荠菜的花粉管识别拟南芥胚囊的效率[7]。
AtLURE1基因家族全部敲除的多重突变体和PRK6突变体一样没有育性缺陷，只是花粉管延迟进入隔膜。这一结果表明，AtLURE1-PRK6通路不是雌性器官吸引花粉管的唯一信号，而是一类通过增加自身花粉管竞争能力，促进与亲缘关系相近物种产生遗传隔离的信号。XIUQIU 小肽是一类与AtLURE1相关的十字花科富含半胱氨酸的保守肽，由助细胞表达分泌，并且也分布于助细胞丝状器，其基因位于转录因子MYB98调控通路下游。XIUQIU 小肽对花粉管的吸引不通过PRK6传递信号，并且其对于花粉管的吸引无物种特异性[51]。对花粉管导向的研究仍然有许多问题需要解决，如小肽的作用距离等，同时花粉管吸引与物种生殖隔离之间的关系也需进一步探索。
5 总结和展望
性反转相比植物激素，小肽激素种类众多、功能复杂，整体研究还处于初级阶段。已知小肽的功能还有很多待研究的问题，也还有更多的小肽激素有待于发现。对于所有小肽激素而言，有一些亟待解决的问题将是未来研究的方向。例如：小肽激素信号通路是如何跟经典激素信号整合的？其他物种中发现的转录后修饰是否存在于植物小肽激素？受体识别多个配体的机制是怎样的？小肽的细胞内转运和远距离细胞间转运是怎样发生的？小肽激素的表达是如何调控的？另外，基于小肽的功能特异性及化学合成的方便性，其在农业生产中的应用有待开发利用。
(2021年1月18日收稿)
■
杨氏模量数据处理
参考文献
[1] HSU P Y, BENFEY P N. Small but mighty: functional peptides
encoded by small ORFs in plants [J]. Proteomics, 2018, 18(10): e1700038.
[2] PEARCE G, STRYDOM D ，JOHNSON S, et al. A polypeptide
from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins [J]. Science, 1991, 253(5022): 895-897.
薄膜技术
[3] MATSUBAYASHI Y. Posttranslationally modified small-peptide
signals in plants [J]. Annual Review of Plant Biology, 2014, 65: 385-413.
[4] CHEN Y F, MATSUBAYASHI Y , SAKAGAMI Y . Peptide growth
factor phytosulfokine-alpha contributes to the pollen population effect [J]. Planta, 2000, 211(5): 752-755.
[5] TANG W, INÉS EZCURRA D K, COTTER R, et al. LeSTIG1, an
extracellular binding partner for the pollen receptor kinases LePRK1 and LePRK2, promotes pollen tube growth in vitro [J]. Plant J, 2004, 39(3): 343-353.
[6] TAKEUCHI H, HIGASHIYAMA T. Tip-localized receptors control
pollen tube growth and LURE sensing in Arabidopsis [J]. Nature, 2016, 531(7593): 245-248.
[7] WANG T, LIANG L, XUE Y , et al. A receptor heteromer mediates
the male perception of female attractants in plants [J]. Nature, 2016, 531(7593): 241-244.
[8] MÁRTON M L, CORDTS S, BROADHVEST J, et al. Micropylar
pollen tube guidance by egg apparatus 1 of maize [J]. Science, 2005, 307(5709): 573-576.
[9] PEARCE G, MOURA D G, STRATMANN J, et al. RALF, a
5-kDa ubiquitous polypeptide in plants, arrests root growth and development [J]. PNAS, 2001, 98(22): 12843-12847.
[10] CAO J, FENG S. Evolution of the RALF gene family in plants: gene
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议