β片层阻断肽Ｈ
１０２对ＡＤ小鼠识别记忆能力和脑内ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ自噬相关通路的影响 单尚然，蒋 方，徐淑梅△
（天津医科大学生理学教研室，天津３０００７０）
【摘要】 目的：研究β片层阻断肽Ｈ１０２对ＡＰＰ／ＰＳ１双转基因ＡＤ小鼠脑内ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ自噬通路相关蛋白表达的影响。方法：将３ ０只六月龄的ＡＰＰ／ＰＳ１双转基因雄性ＡＤ小鼠随机分为ＡＤ组和Ｈ１０２干预组，将同月龄同背景的Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性小鼠设为对照组（ｎ＝１５）。在ＳＰＦ级饲养给药，Ｈ１０２干预组的小鼠每天同一时间段经鼻腔给Ｈ１０２多肽溶液５μｌ（５．８ｍｇ／ｋｇ），对照组和ＡＤ组小鼠每日给予等量的空白辅料溶液。持续给药３０ｄ后通过新物体识别实验来测试各组小鼠的记忆识别能力。用免疫组化和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术来检测磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（Ｐ ＡＭＰＫ）、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｐ ｍＴＯＲ）、微管相关蛋白轻链３Ⅱ与微管相关蛋白轻链３Ⅰ的比值（ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ）在小鼠脑组织中的表达。结果：与对照组相比，ＡＤ组小鼠的新物体识别指数（ＲＩ）显著降低（Ｐ＜０．０５），小鼠脑内Ｐ ＡＭＰＫ、ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ比值显著降低（Ｐ＜０ his系统
．０５），Ｐ ｍＴＯＲ蛋白表达显著升高（Ｐ＜０．０５）；与ＡＤ组小鼠相比，Ｈ１０２干预组小鼠的ＲＩ显著提高（Ｐ＜０．０５），小鼠脑组织中Ｐ ＡＭＰＫ、ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ比值显著升高（Ｐ＜０．０５），Ｐ ｍＴＯＲ蛋白表达显著降低（Ｐ＜０．０５）。结论：Ｈ１０２可通过激活ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ自噬相关通路，改善ＡＤ小鼠的识别记忆能力。
【关键词】阿尔茨海默病；自噬通路；新物体识别；Ｈ１０２肽；小鼠
【中图分类号】Ｒ３３８．８ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０１９）０１ ００１ ００７【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５７４９．２０１９．００１
ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＨ１０２ｏｎｔｈｅｍｅｍｏｒｙｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙａｎｄＡＭＰＫ ｍＴＯＲ
ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄｐａｔｈｗａｙｉｎＡＤｍｉｃｅ
ＳＨＡＮＳｈａｎｇ ｒａｎ，ＪＩＡＮＧＦａｎｇ，ＸＵＳｈｕ ｍｅｉ
△
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆβ ｓｈｅｅｔｂｌｏｃｋｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅＨ１０２ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＭＰＫ ｍＴＯＲａｕｔｏｐｈａｇｙｐａｔｈ ｗａｙ ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎＡＰＰ／ＰＳ１ｄｏｕｂｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡＤｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｉｒｔｙｍａｌｅＡＰＰ／ＰＳ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍａｌｅＡＤｍｉｃｅｏｆ６ｍｏｎｔｈｓｏｌｄｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏＡＤｇｒｏｕｐａｎｄＨ１０２ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，ａｎｄＣ５７ＢＬ／６Ｊｍａｌｅｍｉｃｅｏｆｔｈｅｓａｍｅａｇｅｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｎ＝１５）．ＴｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅＨＦｇｒｏｕｐｗｅｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｗｉｔｈ５μｌ（５．８ｍｇ／ｋｇ）ｏｆＨ１０２ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｎａｓａｌｃａｖｉｔｙａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅｐｅｒｉｏｄ，ａｎｄｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅＡＤｇｒｏｕｐｗｅｒｅｇｉｖｅｎｔｈｅｓａｍｅａｍｏｕｎｔｏｆｂｌａｎｋａｄｊｕｖａｎｔｓｏｌｕ ｔｉｏｎｄａｉｌｙ．Ｔｈｅｍｅｍｏｒｙｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙａｎｅｗｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ３０ｄａｙｓａｆｔｅｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＡＭＰ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（Ｐ ＡＭ
ＰＫ），ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｐ ｍＴＯＲ）ａｎｄｒａｔｉｏｏｆＬＣ３ⅡｔｏＬＣ３Ⅰ（ＬＣ３ＩＩ／Ｉ）ｉｎｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｎｅｗｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎｄｅｘ（ＲＩ）ｏｆｔｈｅＡＤｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅＰ ＡＭＰＫａｎｄＬＣ３ＩＩ／Ｉｒａｔｉｏｓｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｏｆｔｈｅｍｉｃｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰ ｍＴＯＲｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｉｎ ｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＡＤｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＲＩｏｆｔｈｅＨ１０２ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅＰ ＡＭＰＫａｎｄＬＣ３ＩＩ／Ｉｒａｔｉｏｓｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｏｆｔｈｅｍｉｃｅｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰ ｍＴＯＲｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｈ１０２ｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄｍｅｍｏｒｙａｂｉｌｉｔｙｏｆＡＤｍｉｃｅｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＡＭＰＫ ｍＴＯＲａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄｐａｔｈｗａｙ．
证券投资基金运作管理办法
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】 Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ； ａｕｔｏｐｈａｇｙｐａｔｈｗａｙ； ｎｅｗｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ； Ｈ１０２ｐｅｐｔｉｄｅ； ｍｏｕｓｅ
【基金项目】国家科技重大专项基金资助（２００９ＺＸ０９１０３０２９）；
天津市科技支撑重点项目基金资助（１６ＹＦＺＣＳＹ０１０００）【收稿日期】２０１８ ０９ １１【修回日期】２０１８ １２ １９ △【通讯作者】Ｔｅｌ：１３０１２２６８１３９；Ｅ ｍａｉｌ：ｘｕｓｈｍ＠ｔｉｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一
种与年龄相关、进行性发展的中枢神经系统退行性
疾病［１］
。该病起病隐匿，由多因素引起，学习记忆
力减退、认知功能障碍，最终导致生活自理能力完全
丧失，是痴呆最常见的临床表现形式［
２］
。ＡＤ的主要病理学改变是β 淀粉样蛋白在神经元细胞外异
１
中国应用生理学杂志，２０１９，３５（１）
常沉积形成的老年斑（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅｓ，ＳＰ）和细胞内自我聚集的ｔａｕ蛋白的过磷酸化所形成的神经元纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴｓ）。随着病程的发展，大脑被这些老年斑和神经纤维缠结影响，造成学习和记忆力的的衰退［３］。关于阿尔茨海默症的致病机理，目前仍有争论，有多个学说的提出。目前β样淀粉样蛋白（ａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａβ）级联学说得到广大学者的广泛认可，作为老年斑主要成分的Ａβ可能是ＡＤ的原发性病理因子，是影响ＡＤ发病的核心因素［４］。本课题组的β片层阻断肽Ｈ１０２是专门针对Ａβ设计的老年痴呆的新型候选药物，分子组成为十肽水溶物，它能够有效抑制Ａβ的折叠和聚集，减少Ａβ的含量，制约Ａβ对神经元造成损伤，从而影响下游病理过程［５］。本课题组前期已经证实β片层阻断肽Ｈ１０２影响Ａβ的生成，包括Ｈ１０２能够与β淀粉样肽相结合，抑制Ａβ的折叠和聚集；Ｈ１０２参与ＡＰＰ的代谢，影响Ａβ的生成等。但是对Ｈ１０２是否影响Ａβ清除的自噬相关通路未有涉及，因此设计本实验观察Ｈ１０２对激活自噬通路的作用。
泉水的资料
在真核细胞中，自噬是一种正常的调节性回收衰老细胞组分、清除结构或功能异常细胞器或蛋白聚合物的细胞生理过程。在生理情况下，细胞维持一种较低水平的自噬［６］。当体内积累过多异常折叠的蛋白质时，就会激活相关自噬通路来加速对异常蛋白的清除。自噬作为细胞内清除异常折叠蛋白质、受损细胞器和其他有害物质的主要途径，对β淀粉样肽产生和清除的平衡具有重要作用［７］。近年来，大量研究表明腺苷酸活化蛋白激酶（ＡＭＰ ａｃ ｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰＫ）不仅在维持细胞能量平衡上发挥重要作用，还可以通过细胞内多条通路影响细胞的自噬过程，其中最主要的通路就是胞浆内的ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ信号通路，这一通路得到广泛研究［８］。本研究旨在观察Ｈ１０２对ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ自噬通路相关蛋白的影响，以探讨Ｈ１０２是否可以通过激活自噬途径减少Ａβ，对ＡＤ起到一定的的作用。
１ 材料与方法
１．１ 材料
６月龄ＡＰＰ／ＰＳ１双转基因ＡＤ雄性小鼠３０只，同月龄同背景的Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性小鼠１５只，体重（３０．０±１．６）ｇ，购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于天津医科大学动物科学部ＳＰＦ级实验动物中心。β片层阻断肽Ｈ１０２由上海吉尔生化有限公司采用固相合成法合成。ＪＬｂｅｈｖ １新物体识别系统购自北京伯豪生物技术有限公司；免疫组化中ＤＡＢ试剂盒、即用型
ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司，生物素二抗试剂盒购自北京鼎国生物公司；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ中β ａｃｔｉｎ抗体购自北京中杉金桥生物公司，Ｐ ＡＭＰＫ抗体购自ＣＳＴ公司，Ｐ ｍＴＯＲ抗体、ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ抗体购自ａｂｃａｍ公司。１．２ 动物分组及给药方法
将３０只６月龄的ＡＰＰ／ＰＳ１双转基因雄性ＡＤ小鼠随机分为ＡＤ组和Ｈ１０２干预组（ｎ＝１５）。将同月龄同背景饲养下的１５只Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性小鼠设为对照组。Ｈ１０２干预组的小鼠每天同一时间段经鼻腔给予Ｈ１０２溶液５μｌ（５．８ｍｇ／ｋｇ），对照组和ＡＤ组小鼠每日给予等量的的空白辅料溶液（０．５％壳聚糖、０．１％ＢＳＡ）。持续给药３０ｄ。
１．３ 新物体识别实验
连续给药３０ｄ后，进行新物体识别实验。实验共分３ｄ完成，分别为适应、熟悉、测试三阶段。第１日将各小鼠放入敞箱中自由活动１０ｍｉｎ。第２日在敞箱中放入相同、位置对称的两个物体，让其自由活动５ｍｉｎ进行探索和学习。第３日将其中一个物体换成颜和形状均不同的物体，步骤如第２日继续进行探索和学习。系统自动记录每一只小鼠对两个物体的识别时间，并对生成的数据进行实验分析。熟悉阶段主要是排除位置对实验结果的影响，位置偏爱指数用ＬＩ表示，测试阶段是测试小鼠在对熟悉物体记忆的基础之上对新物体的探索时间，新物体识别指数用ＲＩ表示。
１．４ 脑组织样本的制备
新物体识别实验结束后，用２５％的乌拉坦４ｍｌ／ｋｇ腹腔注射麻醉，０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）灌注至肝肺透明，然后处死在冰上取脑，一半脑组织放入４％多聚甲醛溶液中固定，一半脑组织分离皮层和海马放入液氮中后移入 ８０℃冰箱中保存备用。
１．５ 免疫组织化学染
甲醛固定过的脑组织经修片、脱水、透明、浸蜡、切片进行以下免疫组化实验。脱蜡复水后去离子水浸泡，３％Ｈ
２
Ｏ
２
室温孵育，枸橼酸抗原修复液进行抗原修复。５％ＢＳＡ封闭后，滴加稀释一定的比例的一抗（Ｐ ＡＭＰＫ１∶４００、Ｐ ｍＴＯＲ１∶１００、ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ１∶３００）后，４℃过夜，滴加生物素标记的二抗工作液３７℃避光孵育３０ｍｉｎ，辣根酶标记物（ＳＡＢＣ）工作液３７℃避光孵育３０ｍｉｎ，ＤＡＢ显剂显，镜下控制时间，苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。
２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１９，３５（１）
阴性对照组用ＰＢＳ代替一抗进行染，其余步骤同上。在倒置成像系统下观察并拍摄相同层次的海马和皮层，用ｉｍａｇｅ ｐｒｏｐｌｕｓ６．０软件对染结果进行光密度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）分析。１．６ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验
于 ８０℃冰箱中取出海马和皮质组织，提取总蛋白，ＢＣＡ法定量测定蛋白浓度后调定各组蛋白为等浓度，加适量上样缓冲液，煮沸变性５ｍｉｎ。５％～１２％分离胶５％浓缩胶电泳蛋白分离后进行转膜，５％脱脂奶粉室温封闭２ｈ，加入稀释的一抗（Ｐ ＡＭＰＫ１∶１０００、Ｐ ｍＴＯＲ１∶１００００、ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ１∶３０００），４℃过夜，加入稀释的二抗（１∶１００００），室温下孵育２ｈ，然后ＥＣＬ发光显，蛋白条带曝光。用ｅ
ｍａｇｅＪ软件分析所得条带的灰度值。１．７ 统计学处理
数据以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，采用ＳＰＳＳ２１．０软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析法。
２ 结果
２．１ 新物体识别记忆能力测试结果
实验中各组小鼠熟悉阶段中的位置偏爱指数以及测试阶段中的新物体识别指数如表１所示，实验结果
说明各组小鼠的位置偏爱指数均在５０％左右，说明我们可以排除位置这个因素对测试阶段实验结果的影响；从实验数据中我们能够看出，与对照组相比，ＡＤ组新物体识别指数显著降低（Ｐ＜０．０５），与ＡＤ组相比，Ｈ１０２干预组新物体识别指数显著提高（Ｐ＜０．０５，表１）。
Ｔａｂ．１ ＴｈｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＬＩａｎｄＲＩｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｏｆｍｉｃｅ
（％，珋
ｘ±ｓ，ｎ＝１５）Ｇｒｏｕｐ ＬＩＲＩＣｏｎｔｒｏｌ５１．２７±６．８６６９．６８±８．９１
ＡＤ５２．３４±７．２４５２．２４±７．９８
Ｈ１０２
５１．５８±８．２９
６２．２３±８．２１
＃ ＬＩ：Ｌｏｃａｔｉｏｎｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｉｎｄｅｘ；ＲＩ：Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉ
ｎｄｅｘ；ＡＤ：ＡＰＰ／ＰＳ１ｄｏｕｂｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐ＜０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ；＃Ｐ＜０．０５ｖｓＡＤ
２．２ 免疫组化ＤＡＢ染法测定ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ通路相关蛋白的表达
对Ｐ ＡＭＰＫ、ＬＣ３Ⅱ蛋白免疫组化染结果显示，与对照组相比，ＡＤ组小鼠脑内Ｐ ＡＭＰＫ、ＬＣ３Ⅱ蛋白ＯＤ值显著降低（Ｐ＜０．０５），与ＡＤ组相比，Ｈ１０２干预组小鼠脑内Ｐ ＡＭＰＫ、ＬＣ３Ⅱ蛋白光密度显著提高（Ｐ＜０．０５）。对Ｐ ｍＴＯＲ蛋白，与对照组相比，ＡＤ组小鼠脑内Ｐ ｍＴＯＲ蛋白光密度显著提高（Ｐ＜０．０５），与ＡＤ组相比，Ｈ１０２干预组小鼠脑内Ｐ ｍＴＯＲ蛋白光密度显著降低（Ｐ＜０．０５，表２，图１，图１．１，图１．２见彩图页Ⅰ，图１．３见彩图页Ⅴ）。２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ通路相关蛋白的表达
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，与对照组比较，ＡＤ组小鼠蛋白条带明显变细，颜变浅，Ｐ ＡＭＰＫ、ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ比值显著降低，
差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ＡＤ组相比，Ｈ１０２干预组小鼠脑内Ｐ ＡＭＰＫ、ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ比值显著增加，蛋白条带明显变粗，颜变深，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；对Ｐ ｍＴＯＲ蛋白，与对照组比较，ＡＤ组小鼠蛋白条带明显增粗，颜加深，Ｐ ｍＴＯＲ蛋白蛋白的表达量显著增多，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ＡＤ组相比，Ｈ１０２干预组小鼠脑内Ｐ ｍＴＯ
Ｒ表达明显降低，蛋白条带明显变细，颜变浅，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５，图２．１、２．２，图３）
。
Ｆｉｇ．２．１ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＰ ＡＭＰＫ，Ｐ ｍＴＯＲ，ＬＣ３Ⅱ／Ⅰｒ
ａｔｉｏｌｅｖｅｌｉｎｍｉｃｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｂ：ＡＤ；Ｃ：Ｈ１０２；ＡＤ：ＡＰＰ／ＰＳ１ｄｏｕｂｌｅＴｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ
Ｆｉｇ．２．２ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＰ ＡＭＰＫ，Ｐ ｍＴＯＲ，ＬＣ３Ⅱ／Ⅰｒ
ａｔｉｏｌｅｖｅｌｉｎｍｉｃｅｃｏｒｔｅｘ
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｂ：ＡＤ；Ｃ：Ｈ１０２；ＡＤ：ＡＰＰ／ＰＳ１ｄｏｕｂｌｅＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｔａｂ．２ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡＭＰＫ ｍＴＯＲｒｅｌｅｖａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｍｉｃｅｂｒａｉｎＣＡ１ａｒｅａｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＯＤ，ｎ＝１５，珋ｘ±ｓ）ＧｒｏｕｐＰ ＡＭＰＫ
ＨｉｐｐｏｃａｍｐｕｓＣｏｒｔｅｘＰ ｍＴＯＲ
ＨｉｐｐｏｃａｍｐｕｓＣｏｒｔｅｘＬＣ３
Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ
Ｃｏｒｔｅｘ
浙江大学图书馆Ｃｏｎｔｒｏｌ
７３．０５±９．１５８９．１２±１０．６５
６９．９６±７．３６８６．７５±１１．１６
７９．０３±７．５６
６３．０９±１２．４３
ＡＤ５７．９３±１０．７５ ７４．９１±１２．７２
９０．３３±８．３６ ９６．８７±１０．０７
巨大奇迹５６．５２±１０．１６
４３．２２±７．０１
Ｈ１０２
８５．３６±７．５５＃８３．０８±８．４３
＃
４８．６２±３．３２＃６７．７４±１１．４０
＃
９４．２１±８．００
＃
８２．０９±９．９５
＃
ＡＤ：ＡＰＰ／ＰＳ１ｄｏｕｂｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐ＜０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ；＃Ｐ＜０．０５ｖｓＡＤ
３
中国应用生理学杂志，２０１９，３５（１）
Ｆｉｇ．３ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＰ ＡＭＰＫ，Ｐ ｍＴＯＲ，ＬＣ３Ⅱ／Ⅰｒａｔｉｏｌｅｖｅｌｉｎｍｉｃｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓａｎｄｃｏｒｔｅｘ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１５）
ＡＤ：ＡＰＰ／ＰＳ１ｄｏｕｂｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１
３ 讨论
大脑皮层、海马的神经元缺失是阿尔茨海默病（ＡＤ）的主要病理结果［９］，所以我们本课题的取材是小鼠大脑的皮层和海马。ＡＤ的主要临床特征是学习记忆力减退、认知功能障碍。新物体识别记忆能力测试结果表明，Ｈ１０２干预组的新物体识别指数要明显高于ＡＤ组，提示Ｈ１０２对于ＡＤ的预防和具有一定的积极作用。
大量研究表明，Ａβ在细胞外的异常聚集形成ＳＰ［１０］，是ＡＤ的重要物质，故清除异常聚集的Ａβ至关重要，这个过程主要就是自噬［１１］，Ｈ１０２在小鼠脑区通过自噬来清除Ａβ是本课题想要探讨的另一内容。自噬过程包括自噬泡的形成、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合三个阶段［１２］。腺苷酸活化蛋白激酶（ＡＭＰ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰＫ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴ
ＯＲ）、微管相关蛋白轻链３（ＬＣ３）是自噬过程中关键的蛋白质分子。在自噬通路中ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ通路，已经得到广泛的研究［８］。ＡＭＰＫ是三聚体复合体，由催化亚单位α和调节亚单位β和γ组成。在脑组织中α亚型较为丰富［１３］。ＡＭＰＫ是能量感受器，主要协调代谢和能量的需要，大量研究表明ＡＭＰＫ作为哺乳动物细胞代谢传感器参与神经变型性变的调控［１４］。免疫组化和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验结果均表明，Ｈ１０２能够显著活化ＡＭＰＫ，这可能是因为神经元ＡＭＰＫ信号激活主要靠胞浆ＡＭＰ和Ｃａ２＋水平的增高，而Ｈ１０２多肽本质是十种氨基酸组成，可以作为ＡＭＰＫ的激动剂，来通过活化ＡＭＰＫ诱导自噬，清除异常聚集的Ａβ。作为自噬调控的中心分子，ｍＴＯＲ能够调节细胞周期及细胞自噬等多种细胞进程。可表现出＂活性开关＂样的作用，激活或抑制自噬通路，保持生理环境的动态平衡。Ｐａｒｋ等［１５］证明，西洛他唑能激活ＡＭＰＫ，降低ｍＴＯＲ的磷酸化水平，从而抑制ｍＴＯＲ活性，促进自噬体形成，减少Ａβ的积累，发挥中枢神经保护作用。本实验结果显示，ＡＤ小鼠脑内ｍ ＴＯＲ过度磷酸化，自噬出现障碍，而Ｈ１０２干预组，Ｐ ｍＴＯＲ显著降低，表明Ｈ１０２可能通过激活ＡＭＰＫ抑制ｍＴＯＲ活性来诱导自噬，加速Ａβ的清除。ＬＣ３是自噬标志物，当自噬泡成熟时，ＬＣ３ Ｉ转变为ＬＣ３ ＩＩ（即自噬体膜型），ＬＣ３ ＩＩ／Ｉ比值的大小被广泛用于评估自噬激活的程度［１６］。本实验中，ＡＤ组ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ的比值很小，提示ＡＤ小鼠脑内出现自噬障碍，Ｈ１０２可显著提高ＡＤ小鼠脑内ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ的比值，表明Ｈ１０２干预组能够重新激活自噬通路加速对Ａβ的清除作用。
由此可知，在ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ通路中，Ｈ１０２作为多肽分子，可以通过激活ＡＭＰＫ，抑制ｍＴＯＲ来诱导自噬，加速对Ａβ的清除作用，改善ＡＤ小鼠的学习记忆能力，达到对ＡＤ小鼠的目的。
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