2019年9月第5期(总第198期)草食家畜(双月刊) 10.16863/jki.1003-6377.2019.05.005
买尔哈巴·艾合麦提1,2，田月珍3，柏妍1，杨雪梅1，田可川3*，黄锡霞1*
(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052;
2.新疆阿克苏地区畜牧技术推广中心，新疆阿克苏843000;
3.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐830000)
摘要：本研究旨在挖掘影响中国美利奴羊(新疆型)羊毛性状的关键候选基因及分子标记。本研究的实验动物为中国美利奴羊(新疆型)，通过采用PCR-SSCP技术对GPR143基因外显子6核苷酸的多态性进行检测分析，并利用SAS8.1软件最小二乘法分析其突变位点的遗传效应。中国美利奴羊(新疆型) GPR143基因外显子6发生了突变，并形成三种基因型，在外显子6上得到AA、BB和AB三种基因型。在217bp处AA基因型发生碱基突变，即G→T;AB基因型在229bp处发生碱基突变，即C→T。通过对基因型与羊毛性状的关系进行关联性分析后发现,BB基因型的光泽显著高于AA和AB基因型。GPR143基因外显子6的突变可能是影响羊毛光泽的重要位点。 关键词:GPR143基因；多态性；毛性状；中国美利奴羊(新疆型)
中图分类号:S826文献标识码:A文章编号:1003-6377(2019)05-0022-08
巨大的国内市场需求为中国细毛羊产业的发展创造了机遇，同时也形成了挑战，传统的育种方法已经不能完全满足羊毛生产与市场需求，因此，分子育种在细毛羊的选种选育过程中尤为重要。中国美利奴羊(新疆型)是在1984年由澳洲美利奴公羊与新疆细毛羊杂交培育而成的毛用细毛羊品种[1-2]，在该品种审定之后，就继续开展有计划、有规模的选种选育工作。该品种羊的肌肉发达、体质健硕、适宜放牧，并且具有毛长且弯曲、毛丛结构好、呈油白和乳白、净毛量高和含量均匀适中等特点。艾买提·买买提[3]和玛依拉·吐尔逊[4]采用PCR-SSCP技术对中国美利奴羊(新疆型)体中的KAP基因和KRT基因分别进行了多态性检测以及关联性分析了这两个基因与羊毛性状的关系；冯静等[5-7]通过采用克隆测序法和基金项目：国家自然科学基金项目(31360543);“十二五”自治区重大专项“新疆毛、绒羊新品种选育与产业化示范”
(201230116-6)；现代农业产业技术体系建设专项“国家绒毛用羊产业技术体系”(CARS-40)
作者简介：买尔哈巴·艾合麦提(1991-)，女，新疆人，研究方向：动物遗传育种。E-mail:1143473410@qq
通讯作者：黄锡霞(1963-)，女，新疆人，教授，博士生导师，研究方向：动物遗传育种。E-mail:au-huangxixia@163 田可川(1963-)，男，宁夏人，研究员，博士生导师，研究方向：动物遗传育种。E-mail:tiankechuan@gamil
收稿日期:2019-06-27，修回日期:2019-07-03
振动器2019年9月第5期(总第198期)草食家畜(双月刊) PCR-SSCP技术对KAP1.1、KAP1.3及KAP6.1基因的多态性及其与羊毛性状的关系在中国美利奴羊(军垦型)体中进行了研究；许汉峰[8]对中国美利奴羊(军垦型)体中角蛋白关联蛋白基因(KAP及KRT 基因)与绵羊毛品质的相关性进行了研究分析。这些研究都为影响中国美利奴羊(新疆型)的羊毛性状候选基因的研究分析提供了方法和理论依据。GPR143基因也被称为OA1蛋白，作为G偶联蛋白受体家族的成员之一[9-10]，编码包含404个氨基酸残基组成的蛋白质，这种蛋白质是一种黑素小体膜整合性蛋白，重点是在视网膜的素上皮层、皮肤的黑素细胞以及虹膜中表达，在眼睛、皮肤以及毛发中的素蛋白质的形成中起重要作用[11]，并发挥着转导信号的作用，其功能是调节黑素小体的生长[12]。本研究目的是通过分析中国美利奴羊(新疆型)体内的GPRl43基因的遗传特征来寻多态性，并对GPRl43基因的多态性与羊毛重要经济性状进行关联性分析，以期发现GPRl43基因对羊毛毛品质性状的影响。
1材料与方法
1.1实验材料
本试验数据由新疆伊犁新源县巩乃斯种羊场提供，试验动物为新疆巩乃斯种羊场所供应的中国美利奴羊(新疆型)周岁羊，共采集550只中国美利奴羊(新疆型)的毛样及血样，其中，周岁羊418只，两周岁羊132只。
1.2实验方法
1.2.1数据收集和整理
收集巩乃斯种羊场2011-2012年418只的周岁羊与2010-2012年132只的两周岁羊羊毛品质鉴定记录，用EXCEL软件进行初步整理。
1.2.2引物设计
根据NCBI提供的绵羊GPR143基因序列(Gene Bank登录号NC-019484)，采用引物设计软件Primer Premier5.0进行引物设计，并送至上海Sangon Biotech公司合成。引物序列见表1。
表1引物序列
名称引物序列温度
(℃)大小(bp)
GPR143F:TACTGAAGGGAAGACAAGGC
53.0℃287bp R:AGGTTACGGCTGTAGACTGG
1.2.3PCR扩增及产物检测
PCR扩增反应体系的模板是提取的基因组DNA，总体积是20μL，反应体系见表2。通过梯度PCR 寻求样品的最佳退火温度,PCR的扩增程序见表3，将扩增产物放置于2%琼脂糖凝胶并在100V的条件下电泳检测20min。
表2PCR反应体系
基因2×PCR DNA模板上游引物下游引物R Nase-free ddH2O
GPR14310μL1μL0.8μL0.8μL7.4μL
2019年9月第5期(总第198期)
草食家畜(双月刊)
表3PCR 反应程序
1.2.4PCR-SSCP 凝胶电泳
取10μL PCR 扩增产物与8μL 变性缓冲液，将其离心混匀,98℃变性10min ，之后立刻冰浴20
min 。将变性后的PCR 扩增产物全部上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，在300V 的电压下
预电泳30min ，随后180V 恒压电泳16h 。在聚丙烯酰胺凝胶电泳结束之后，采用银染法对凝胶进行染，并通过显情况判定其基因型。1.3数据统计与分析
运用统计软件计算基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数、纯合度及杂合度及多态信息含量
(PIC )，并用Hardy-Weinberg 平衡检验品种内基因型的分布。用SAS8.1软件对GPR143基因的不同基因型和中国美利奴羊(新疆型)羊毛性状进行关联分析。分析模型如下:
ap系统
Y ijk =μ+a i +b j +q k +e ijk
其中,Y ijk =分析性状的观测值;μ=总体均值;a i =基因型效应;b j =别效应;q k =年龄效应;e ijk =随机误差。2结果
2.1
DNA 完整性检测结果
用0.8%琼脂糖进行凝胶电泳检测DNA 模板。如图1所示,DNA 纯度高、质量良好，可直接作为模板2014年南京青年奥林匹克运动会开幕式
DNA 使用。
反应程序温度时间预变性95℃3min 变性95℃3s 退火53℃30s 延伸72℃30s 延伸72℃10min 保存
4℃
沈晗耀永久
循环35次
}
图1DNA 检测结果电泳图
2019年9月第5期(总第198期)草食家畜(双月刊)
2.2
GPR143基因的PCR 检测和PCR-SSCP 多态性检测结果
由图2可知，用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行检测，发现GPR143基因的PCR 产物大小
为287bp 。结果显示，扩增获得的片段长度与预期的大小一致，并且未形成引物二聚体，可以在后续试验的多态性检测中运用。
对GPR143基因的PCR 扩增产物进行PCR-SSCP 分析，由图3可知,GPR143基因的扩增片段在中国美利奴羊(新疆型)体中存在三种不同的基因型，分别命名为AA ,AB ,BB 型。泳道1、2、4、5、6、7、8、9、11为AA 基因型；泳道3和12为BB 基因型；泳道10为AB 基因型
。
图2
PCR 扩增结果电泳图图3PCR-SSCP 电泳图
2.3多序列对比
由图4可知，对PCR 扩增产物进行DNA 双向测序，将测序结果与已知的绵羊GPR143基因的CDs
序列进行比对，在外显子6上得到AA 、BB 和AB 三种基因型。在217bp 处AA 基发生碱基突变，即G →T ；在229bp 处AB 基因型发生碱基突变，即C →T
。
图4不同基因型个体多序列对比图
2.4GPR143基因外显子6基因频率和基因型频率分析
由表4可知,GPR143基因外显子6的三种基因型AA 、AB 和BB 的基因型频率分别为0.76、0.16和
0.08。其中A 等位基因频率为0.84,B 等位基因频率为0.16。经过χ2检验发现，该位点在中国美利奴羊(新
疆型)体中处在Hardy-Weinberg 不平衡状态(P<0.05)。根据确定位点多态性的标准,GPR143基因的外显子6的多态信息含量为0.23，属于低度多态位点。
表4GPR143基因外显子6的基因型分布频率及遗传特性
注:“**”表示<0.05;PIC>0.5为高度多态,0.5>PIC>0.25为中度多态,PIC<0.25为低度多态
基因型和基因型频率
样本量
等位基因频率
χ2
AA AB BB 531A B 85.06**0.76(406)
0.16(84)
0.08(41)
0.84
0.16
基因纯合度(Ho )基因杂合度(He )有效等位基因数
(Ne)多态信息含量
(PIC )0.74
0.26
1.360.23
2019年9月第5期(总第198期)草食家畜(双月刊) 2.5GPR143基因与羊毛性状的关联性分析
使用SAS8.1软件分析基因型、别及年龄对羊毛性状的影响。如表5所示，基因型对剪毛量、平均直径、毛纤维直径变异系数、油汗、毛弯曲数、鉴定时体重、剪毛后体重、体格大小、毛长度评分、毛弯曲评分、毛细度评分的影响不显著(>0.05)；而对光泽有显著的影响(<0.05)。别对剪毛量、毛纤维直径变异系数、油汗、鉴定时体重、剪毛后体重、光泽、毛长度评分、毛细度评分有极显著影响(<0.01)；而对平均直径、毛弯曲数、体格大小、毛弯曲评分的影响不显著(>0.05)。年龄对剪毛量、平均直径、油汗、剪毛后体重、光泽、毛弯曲评分有极显著影响(<0.01)；对鉴定时体重有显著的影响(<0.05)；而对毛纤维直径变异系数、毛弯曲数、体格大小、毛长度评分、毛细度评分影响不显著(>0.05)。
表5基因型、别及年龄对中国美利奴羊(新疆型)毛性状的影响
毛性状基因型别年龄2131
剪毛量0.179 3.339**9.556**
平均直径 5.309 3.965101.674**
毛纤维直径变异系数0.41234.796**19.740
油汗0.0330.122** 1.486**
毛弯曲数 4.032 4.63813.817
鉴定时体重7.203102.916**73.168*
剪毛后体重12.264593.350**287.326**
体格大小0.452 3.902 3.923
光泽0.180*0.137**0.530**
毛长度评分 1.4899 2.730** 3.332
毛弯曲评分0.1110.061 1.416**
前列舒安毛细度评分 1.05142.670**8.187
注:**影响极显著(<0.01),*影响显著(<0.05)。
2.6不同基因型与毛性状之间的最小二乘均数、标准误及多重比较
白岩松新书
由表6可知,BB基因型的光泽显著高于AA型和AB型(<0.05);AA、AB、BB型基因的剪毛量、平均直径、毛纤维直径变异系数、油汗、毛弯曲数、鉴定时体重、剪毛后体重、体格大小、毛长度评分、毛弯曲评分、毛细度评分差异不显著(>0.05)。
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