近年来，肠道菌的研究⼗分⽕热，新⽂献数量和质量攀升势头不减，其中关于菌与免疫、代谢、肿瘤和肠脑轴，以及影响菌建⽴的影响因素的研究，在多个热点问题上均有突破性进展。因此，深⼊了解微⽣物多样性对健康的影响，是临床专业研究的需要拓展的⼀个研究领域，涉及从精神病学到胃肠病学等⼀系列学科。 中国投资环境
然⽽随着研究的深⼊，肠道菌与疾病的研究要求越来越⾼，如果说2年前依据不同样本进⾏⾼通量测序鉴定菌差异即可发⼀个不错的⽂章（如多项胃肠道肿瘤相关菌研究发表在GUT、GASTROENTEROLOGY上），现在这项技术只能作为⼀个简单的相关性检测⼿段，肠道菌与疾病的研究已经开始从传统的多组学层⾯的宏观研究转为特定菌株层⾯的精细化研究。但是，肠道菌与疾病的相关性研究作为后续因果机制的基础，必不可少。同时，在2019-2020，仍有不少菌相关性研究发表在GUT等顶级期刊上，通过微⽣物相关⽣物标志物预测临床结局依旧是⽬前的研究热点，关键是良好的课题设计与创新性。今天就为⼤家详细介绍肠道菌与疾病相关性研究的设计⽅法。
⼀、⼈体微⽣物组研究样本选择
样本的选取对任何⼀项临床研究来说都⼗分重要，尤其是在微⽣物组研究中。考虑到微⽣物组的个体差异性，确定临床微⽣物组研究所需的样本尤为关键。那么究竟需要多少样本量？
临床研究，从观察性病例报告到随机对照试验，通常需要建⽴明确且可检验的研究假设。计算把握度（power calculation）和估算最⼩样本量，是充分检验研究假设和得出可以超出研究样本范围、能进⾏推⼴的有统计学意义结论的重要前提条件。临床研究中有两类错误，Ⅰ型错误（假阳性，代表缺乏特异度）错误⽔平⼀般为 5%，Ⅱ型错误（假阴性，代表缺乏敏感度）为 20%或 10%。两组⼈进⾏⽐较时，计算把握度有助于确定避免出现Ⅱ型错误所需的最少样本量，换句话说，研究敏感度较⾼，有助于发现两组之间实际存在的差异。
实验中取样部位，样品采集和储存，样品制备⽅法和分析⽅法均可能影响实验结果，⼀个简单微⽣物组研究所需的受试者样本量和把握度需要可靠的计算⽅法。⼀项临床研究对两组不同克罗恩病（CD）患者的微⽣物落多样性进⾏了⽐较。虽然克罗恩病病灶位置⼀致，但在整个病程中其表型可能有明显差异。
当采⽤Faith's PD的⽅法来评估微⽣物α多样性时，尽管在样本量为 20 时即可得出显著性差异（α<0.05），但是实际能够检验出这种差异的概率⼩于 30%。因此，按照 80%把握度检验各组间菌多样性的差异，按照差异度 0.55 计算，最少需要患者⼈数为 110 ⼈（每组 55 ⼈）。如果采⽤基于
系统发育的β多样性（unweighted UniFrac）来检验假设，达到显著性为 5%、统计效⼒为 80%的中等效应值（0.60）所需患者总数约为 100 例(每组 50 例)。
但是，招募 50 名以上具有特殊疾病表型患者的组织⼯作极具挑战性，如果时间允许的话，建议提前开展⼀些预实验。此外，如果将药物、年龄、饮⾷或体重指数等因素纳⼊考虑范畴，研究将变得愈加复杂。在这样的情况下，应该选择满⾜较⼤的效应值。柯尔特一家
⼆、⼈体微⽣物组研究⽅法
随着⼆代、三代基因测序技术不断⾰新，同时价格不断降低，通量不断增加，这些技术上的进步为全⾯开展⼈体微⽣物组的研究提供了有⼒⽀持。其中Illumina等⼆代测序平台应⽤最为⼴泛，虽然测序长度较短（如NovaSeq 6000系统最长测序为双端250bp，即PE250），但测序量⾼。
（1）16S rRNA基因测序
16S 测序利⽤细菌16S rDNA序列测序的⽅法对细菌进⾏种属鉴定，可以对细菌分类及种属丰度情况快速鉴定。其优点是不需要对细菌进⾏分离培养，能鉴定到许多不能培养的，未知的新菌，同时⽅法便捷且速度快。但是由于种间差异⼩，16S不能鉴定到种，需要其他⼿段如（宏蛋⽩组，宏代谢组）补充，同时16S基于PCR扩增，需要注意假阳性。（2）宏基因组(Metagenome)
宏基因组测序⽅法是把所有微⽣物的DNA信息，打断后把所有序列信息测出来，从⽽能得到⽐16S更丰富的信息。宏基因组测序除了可以鉴定物种组成和丰度外，还能对菌株的功能进⾏分析。
（3）宏转录组（Metatranome）
宏转录组指⽣态环境中全部微⼩⽣物的 mRNA合集。其很多流程与功能与宏基因组相似，只是在RNA分⼦⽔平上，并且过滤掉16S rRNA等⾮编码RNA。宏转录组的关注的重点是差异表达基因分析，表现在微⽣物的功能上。
（4）宏蛋⽩组（Metaproteomics）
宏蛋⽩组是指特定时刻下，环境微⽣物所表达的所有蛋⽩。所研究种类⾮常多样化，⽐如活性淤泥中的微⽣物，海洋微⽣物，⼟壤中的微⽣物，发酵⾷品中的微⽣物，肠道微⽣物，粪便、黏膜腔等。
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（5）代谢组学(metabolomics)
代谢组是继基因组学和蛋⽩质组学之后发展起来的新兴的组学技术，是系统⽣物学的组成部分。宏代谢学组是特指环境微⽣物在特定时刻下所有的⼩分⼦代谢物。代谢组学可以应⽤在检测临床诊断标志物（biomerker）和药物靶点（代谢物KEGG通路），研究平台主要有LC-MS和GC-MS2种。
三、⼈体微⽣物组的多组学研究
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⽬前微⽣物组研究中最直接⾼效、成本最低的⽅法是扩增⼦测序，如鉴定细菌落的16S rRNA基因测序，鉴定真菌落的ITS测序。
以2020年最新发表在GUT上的胃菌研究为例，作者将587名HP阳性的患者随机分配为HP根除组和安慰剂组，通过16S测序检测了404份胃活检样本，发现根除HP后，胃菌（⾮HP）参与胃癌发展。16S+严谨的实验设计，即使在2020也可以发表⾼分⽂章。
但扩增⼦测序⽆法提供微⽣物所携带的基因信息，如果采⽤宏基因组，即可对细菌、真菌、病毒等多种微⽣物基因进⾏测序，分析其基因的功能与可能参与的代谢通路。但是使⽤宏基因组测序⽆法区分微⽣物的存活状态。因此，可以使⽤宏转录组检测具有功能活性的微⽣物结构，使⽤宏蛋⽩组检测具有功能活性的微⽣物表达的蛋⽩质信息，或者⽤代谢组检测功能活性微⽣物产⽣的代谢产物。
⽬前由于实验技术和分析⽅法不够完善，⽬前微⽣物检测⼯作主要集中在DNA⽔平（16S和宏基因组）和代谢物⽔平（代谢组检测）的联⽤。例如2020年另⼀篇发表在GUT上的⽂章，作者通过代谢组和16S测序联⽤，检测分析⽅法⽤减肥⼿术的孕妇的肠道菌及其代谢物。
由此可见，即便在“后肠道菌时代”，肠道菌与疾病相关研究逐渐从相关性向因果关系和机制探究发展，从传统的多组学层⾯的宏观研究转为特定菌株层⾯的精细化研究。但是，⽬前⼤部分的因果关
系研究还处于描述阶段，⾼通量测序仍然是全⾯认识肠道菌的起点。随着我们探索更多的⼈与疾病，同时随着技术的发展，我们会持续地进⼀步发现更多的肠道微⽣物与疾病、药物的关联。
参考：
[1] Casals-Pascual C, Gonzalez A, Vazquez-Baeza Y, et al.Microbial Diversity in Clinical Microbiome Studies: Sample Size and StatisticalPower Considerations. Gastroenterology 2020;158:1524-8.（热⼼肠研究院：临床微⽣物组研究，要多少样本才够？）
[2] Sung JJY, Coker OO, Chu E, et al. Gastric microbesassociated with gastric inflammation, atrophy and intestinal metaplasia 1 yearafter Helicobacter pylori eradication. Gut 2020;69:1572-80.
[3] West KA, Kanu C, Maric T, et al. Longitudinalmetabolic and gut bacterial profiling of pregnant women with previous bariatricsurgery. Gut 2020.
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