DOI: 10.12131/20200193
文章编号： 2095 − 0780 −（2021）02 − 0087 − 10
马启伟1, 2，郭 梁2, 3，刘 波2, 3，刘宝锁2, 3，朱克诚2, 3
，
郭华阳2, 3，张 楠2, 3，杨静文2, 3，张殿昌
2, 3
（1. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306； 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源
开发利用重点实验室，广东 广州 510300； 3. 广东省海洋生物种业工程技术研究中心，广东 广州 5103
00）摘要： 为了探讨牛磺酸对卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus ) 肠道微生物菌结构和免疫功能的影响，试验以鱼粉、发酵豆粕和玉米蛋白粉为基础蛋白源配制了牛磺酸质量分数分别为1.3 g·kg −1
(T0)、4.4 g·kg −1
(T1)、7.4 g·kg
电话卡复制−1
(T2)、10.5 g·kg −1
(T3)、12.7 g·kg −1
(T4)的等氮等脂饲料。将750尾卵形鲳鲹 (81.0±0.5) g 随机分为5组 (每组150尾，分为3个平行)，试验为期56 d 。高通量测序结果显示在卵形鲳鲹肠道内共获得87 707条序列，能够注释到数据库的OTUs 数目为5 130 (95.32%)，在门水平上，变形菌门、软壁菌门、螺旋体门为优势菌。Al-pha 和Beta 多样性分析表明，T2组中的肠道微生物丰富度和多样性最低，T1和T4组间物种组成差异较大(P <0.05)。随外源性牛磺酸的添加，血清溶菌酶活性显著提高，补体C4和免疫球蛋白含量显著增加 (P <0.05)；各试验组ToTLR-1、ToTLR-2、ToTNF-α和ToIL-1β基因表达量显著降低 (P <0.05)；T1、T2和T4组的ToNFkB P 65基因表达量显著低于对照组 (P <0.05)；T3和T4组ToIL-10基因表达量显著高于对
照组 (P <0.05)。该试验结果显示，外源牛磺酸对卵形鲳鲹肠道微生物菌和免疫功能具有显著影响。关键词： 卵形鲳鲹；牛磺酸；肠道微生物；免疫功能中图分类号： S963.73
文献标志码： A 开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：
Effect of taurine on intestinal microbes and immune function in
golden pompano (Trachinotus ovatus )
MA Qiwei 1, 2
, GUO Liang 2, 3
, LIU Bo 2, 3
, LIU Baosuo 2, 3
, ZHU Kecheng 2, 3
,
GUO Huayang 2, 3, ZHANG Nan 2, 3, YANG Jingwen 2, 3, ZHANG Dianchang
2, 3
(1. College of Fisheries and Life Science , Shanghai Ocean University , Shanghai 201306, China ; 2. South China Sea Fisheries
Research Institute , Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization , Ministry of Agriculture and Rural Affairs , Guangzhou 510300, China ; 3. Guangdong Provincial Engineer Technology Research Center of Marine Biological Seed Industry , Guangzhou 510300, China )
华再东
Abstract: In order to investigate the effects of taurine on the intestinal microflora structure and immune function of Trachinotus
ovatus , we used fish meal, fermented soybean meal and corn gluten meal as the basic protein sources to prepare the nitrogen and fat feed with taurine contents of 1.3 g·kg −1
(T0), 4.4 g·kg −1
(T1), 7.4 g·kg −1
(T2), 10.5 g·kg −1
(T3), 12.7 g·kg −1
(T4), respectively. Seven hundred and fifty individuals of T. ovatus with an average body mass of (80.0±0.5) g were randomly devided into five groups with
第 17 卷第 2 期南 方 水 产 科 学
Vol.17，No.22021 年 4 月
South China Fisheries Science
Apr. ，2021
收稿日期：2020-09-17；修回日期：2020-12-15
资助项目：现代农业产业技术体系建设专项资金 (CARS-47-G07)；中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助
(2020TD29)；广东省现代农业产业技术体系海水鱼产业创新项目 (2019KJ143)；国家自然科学基金项目 (U20A2064)
作者简介：马启伟 (1995—)，男，硕士研究生，研究方向为水产动物营养和遗传育种。E-mail: **************通信作者：张殿昌 (1977—)，男，博士，研究员，从事水产种质资源与遗传育种研究。E-mail: ******************
three replicates of fifty fish, and the experiment lasted 56 d. Sequencing results show that a total of 87 707 sequences had been ob-tained in the intestine of T. ovatus. The number of OTUs that can be annotated to the database was 5 130 (95.32%). At phylum level, Proteobacteria, Tenericutes and Spirochaetes were the predominant phyla. Alpha diversity and beta diversity analyses show that the richness and diversity of intestinal microbial in T2 group were the lowest and the species composition was significantly different between T1 and T4 groups (P<0.05). The serum lysozyme activity, C4, and Ig increased significantly with the addition of exogenous taurine (P<0.05). The expression of ToTLR-1, ToTLR-2, ToTNF-α and ToIL-1β in each group decreased significantly (P<0.05). The expression of ToNFkB P65 of T1, T2 and T4 groups was significantly lower than that of the control group (P<0.05), while the ex-pression of ToIL-10 of T3 and T4 groups was significantly higher than that of control group (P<0.05). The results indicate that exo-genous taurine has a significant impact on intestinal microflora and immune function.
Key words: Trachinotus ovatus; Taurine; Intestinal microbes; Immune function
端子箱
牛磺酸 (Taurine) 是一种β含硫氨基酸，化学名为2-氨基乙磺酸 (C2H7NO3S)，以游离或者小肽的形式存在于组织中；牛磺酸在鱼体内具有多种生物学功能，在生长性能、神经调节、渗透调节、免疫应答、抗氧化状态、抗应激能力、解毒作用、配子质量、消化酶活性和肠道微生物菌结构中发挥着重要作用[1-2]。有研究表明，植物性蛋白对鱼类的生长、免疫、肠道微生物菌有显著性影响，植物性蛋白替代鱼粉不仅会导致鱼类免疫能力下降，还会造成肠道微生物菌的改变；引起金鲷(Sparus aurata)[3]、大西洋鲑 (Salmo salar)[4]、大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[5]、丝尾鳠 (Hemibagrus wyckioides)[6]、条石鲷 (Oplegnathus fasciatus)[7]、虹鳟 (Oncorhychus mykiss)[8]、日本鳗鲡 (Anguill japonica)[9]肠道菌改变、形态异常并引发炎症反应。然而牛磺酸能够增加植物性蛋白代替鱼粉的使用量，缓解不良反应[10]；一些研究证实饲粮中添加牛磺酸对不同大小和种类的鱼类肠道微生物菌和肠道免疫产生有益影响；例如，饲粮中添加牛磺酸可有效缓解舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax)[11]豆粕替代鱼粉产生的肠道异常并提高草鱼 (Ctenopharyn-godon idella)[12]的肠道免疫功能。
鱼类肠道中的微生物菌被称为宿主的第二基因组，是肠道黏膜屏障的重要组成部分，与机体免疫系统密切相关，肠道菌的稳定保证了肠道健康，如果肠道菌紊乱则极易引起宿主肠道疾病[13]。牛磺酸的多种生理功能已使其成为研究热点，然而，关于牛磺酸对水生动物肠道影响的资料有限，且多集中于消化酶代谢、肠道形态和屏障功能等方面，对肠道免疫的研究较少。Toll样受体 (TLRs)/ NF-κB
信号通路在先天免疫中发挥重要作用，TLRs将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，导致NF-κB转录因子活化，能介导IL-1β以及TNF-α等炎症介质发挥其促炎作用[14]。牛磺酸和多种细胞因子之间存在潜在关系，牛磺酸能够抑制TLRs/ NF-κB信号通路、改善炎症损伤，能够调节免疫基因在鱼肠道中表达[15]；另外，当机体处于炎症时，牛磺酸产生的氯胺也具有抗炎和细胞保护作用[16]。
卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 为暖水性、中上层洄游鱼类，由于其生长迅速、肉质鲜美，已成为南海沿海地区重要的养殖鱼类[17]。研究表明以植物性蛋白替代鱼粉时，会对卵形鲳鲹生长、抗氧化和免疫，以及肠道微生物菌产生显著性影响[18-20]。另外，本试验前期研究发现牛磺酸能够提高卵形鲳鲹生长性能和抗氧化能力[21]；基于牛磺酸对植物性蛋白替代鱼粉产生的不利影响具有缓解作用，本试验旨在探讨牛磺酸对卵形鲳鲹肠道微生物菌和免疫方面的影响，为明确植物蛋白替代饲料中添加牛磺酸是否影响鱼体内肠道菌多样性及免疫功能提供有力证据，以期为卵形鲳鲹健康养殖提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验饲料及饲养管理
试验以鱼粉、发酵豆粕和玉米蛋白粉作为蛋白源，鱼油作为脂肪源，共配制了5种不同牛磺酸添加量的等氮等脂饲料，所有饲料原料粉碎后过40目筛网，加入鱼油和水混匀，经过制粒机 (G-500，华南理
工大学) 制成2.5 mm的沉性饲料颗粒，于4 ℃密封保存。基础试验日粮粗蛋白和粗脂肪质量分数分别为427和100 g·kg−1；灰分和水分质量分数分别为83和101 g·kg−1；各组牛磺酸质量分数分别为1.3 g·kg−1 (T0)、4.4 g·kg−1 (T1)、7.4 g·kg−1 (T2)、10.5 g·kg−1 (T3)、12.7 g·kg−1 (T4)[21]。
饲养试验在海南省新村港进行，所有试验用鱼
88南 方 水 产 科 学第 17 卷
均采于中国水产科学研究院南海水产研究所，将750尾大小均一、体质健康的卵形鲳鲹 (81.0±0.5) g 随机分配到15个网箱 (1 m×1 m×1.5 m) 中，随机分成5组 (每组150尾，分为3个平行)。试验开始前使用T0组饲料喂养1周，使试验鱼适应人工饲料与饲养环境。试验开始时试验鱼已饥饿24 h，然后每组鱼用相对应的饲料每天饱食投喂2次 (8:00和16:00)，持续8周。试验期间温度28~32 ℃，pH 7.4~8.3，盐度34~36，溶解氧质量浓度>6.0 mg·L−1。
1.2 样品采集
喂养阶段结束后，将鱼饥饿24 h，从每个网箱中随机取9尾，用丁香酚 (上海医疗器械股份有限公司) 麻醉，使用2.5 mL不含肝素的注射器从尾静脉采血，离心后 (3 000×g, 4 ℃, 10 min) 取血清于−20 ℃保存；冰上解剖取其肠道，剔除肠道周边脂肪，每一样品单独放于对应的2 mL冻存管中，液氮速冻，−80 ℃保存，用于肠道微生物分析(n=9) 和免疫基因的表达 (n=9)。
1.3 血清免疫指标测定
根据酶活试剂盒 (北京华英生物技术研究所)说明书，测定补体C3/C4和免疫球蛋白 (IgA、IgG、IgM) 的含量和溶菌酶 (LZM) 活性。
1.4 肠道微生物多样性测定
1.4.1 DNA提取及PCR扩增 按照天根DNA试剂盒 [ 天根 (北京) 生化科技有限公司 ] 说明书提取卵形鲳鲹肠道细菌DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，Nanodrop 2000检测纯度和浓度。无菌水稀释DNA样本至1 ng·μL−1，使用特异性引物对细菌16S rDNAV3–V4可变区进行PCR扩增，PCR反应体系 (30 μL) 为15 μL的Phusion Master Mix (新英格兰生物实验室)、3 μL的正反引物、10 μL (5~10 ng) 的模板DNA、2 μL的ddH2O。PCR反应条件为98 ℃预变性1 min；98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；
72 ℃延伸5 min。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；对目的条带使用胶回收试剂盒(Qiagen，德国) 回收产物。引物序列见表1。1.4.2 文库构建和上机测序 使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，经过Qubit和Q-PCR定量保证文库合格后，基于Ion S5 XL测序平台，利用单端测序的方法，完成16S V3–V4区域测序。
1.4.3 测序数据处理 从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH (V 1.
2.7, ccb.jhu.edu/software/FLASH/) 对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始数据。对原始数据进行过滤去除干扰序列，得到有效的高质量数据。
利用Uparse软件 (Uparse V7.0.1001, www.drive5/uparse/)对有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析；依据其算法原则，筛选出OTUs的代表序列 (OTUs中出现频数最高的序列)，用Mothur方法与SILVA132 (www.arb-silva.de/) 对每个OTU的代表序列做物种注释，使用MUSCLE (V3.8.31, www.drive5/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时对OTUs进行丰度、Alpha 多样性 (ACE指数、Chao1指数、香农-威纳指数、辛普森指数) 计算、Beta多样性 (主坐标分析和NMDS分析) 分析，以得到样品内物种丰富度和均匀度信息。利用R软件 (V 2.15.3) 绘制稀释曲线。
1.5 肠道免疫基因表达分析
卵形鲳鲹肠道总RNA使用总RNA提取试剂盒 (广州美基生物科技有限公司) 提取，NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) 和1%琼脂糖凝胶电泳检测浓度和质量；使用PrimeScript™ with gDNA Erase逆转录试剂盒逆转录得到cDNA，−20 ℃保存备用。
使用Primer Premier 5设计ToTLR1、ToTLR2、ToNF-kB P65、ToTNF-α、ToIL-1β和ToIL-10的特异性引物，以卵形鲳鲹EF-1α作为内参[22]，引物序列见表2。使用Roche LightCycler 480 II进行基因表达测定，qPCR反应体系为12.5 μL，1 μL cDNA模板 (60 ng·μL−1)，1 μL正反引物，4.25 μL ddH2O和6.25 μL SYBR Pre-mix Ex Taq；反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。每个样品设3个重复，试验数据使用2−△△CT进行计算[23]。
表1 细菌16S rDNA V3—V4可变区引物Table 1 Bacterial 16S rDNA V3–V4 corresponding primers
引物名称Primer name 引物序列 (5'−3') Primer sequence
341F CCTAYGGGRBGCASCAG
806R GGACTACNNGGGTATCTAAT
第 2 期马启伟等: 牛磺酸对卵形鲳鲹肠道微生物及免疫功能的影响89
1.6 数据分析
X ±SE 以上数据采用SPSS 22.0 (IBM) 软件进行处理和单因素方差 (One-way ANOVA) 分析，结果用“平均数±标准误 () ”表示，若差异达到显著水平 (P <0.05)，则采用Tukey's 进行多重比较。
2 结果
2.1 肠道微生物分析
2.1.1 序列分析 通过对Reads 拼接，平均每样品测得87 707条tags ，经过质控平均得到82 257条有效数据，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs ，共得到5 382个OTUs 。通过与数据库Silva132比对，进行物种注释，并对不同分类层级统计发现：能够注释到数据库的OTUs 数目为5 130 (95.32%)，门水平的比例为89.61%。试验组的稀释曲线和Rank Abundance 曲线见图1，各组
绍兴市树人中学稀释曲线逐渐趋于平坦，说明测序数据量渐进合理，测序覆盖范围已基本达到样品中所有的物种。
2.1.2 Alpha 多样性分析 卵形鲳鲹肠道微生物Alpha 多样性指数见图2，Alpha 多样性可以反映样本内的微生物落的丰富度和多样性变化，ACE 指数和Chao1指数反映菌丰富度，香农-威纳指数 (Shannon) 和辛普森指数 (Simpson) 反映菌多样性，且两者间呈现正相关，数值越大，表示菌的丰富度和多样性越高。Alpha 多样性结果显示，随牛磺酸含量的增加，T1、T2和T3组的ACE 指数和Chao1指数显著低于T0组 (对照组，P <0.05)；T2组的香农-威纳指数和辛普森指数最低，香农-威纳指数显著低于T0和T4组，辛普森指数显著低于T0、T3和T4组 (P <0.05)。
2.1.3 Beta 多样性分析 Beta 多样性分析 (图3)可以评估肠道中物种复杂性方面的差异程度，距离
表2 卵形鲳鲹肠道免疫基因引物序列
Table 2 Real-time quantitative PCR primers for immune related genes in T.ovatus
引物名称Primer name 引物序列 (5'−3')Primer sequence
登录号Accession No.用途
Amplification target
ToTLR-1F: GAACCTTCTGATGCTGAATCTG R: TGCTCCAAGTGCTAATCTCT MG762971.1qRT-PCR ToTLR-2F: CTCCACCTTGCGATACCT R: TCCAACACCTCCAGAGATG MG762972.1qRT-PCR ToNFkB P 65F: GTTCGCATCTCGCTCGTAA R: TGGCCTCATTCACATCCTT
MN233364.1qRT-PCR ToIL-1βF: GGAGACTGTGGAGGACAAGAGC R: GCGGGCAGACATGAAGGTG MK224504.1qRT-PCR ToIL-10F: AGTCAGTCTCCACCCCCATCTT R: GCCCACTGGAGTTCAGATGCT KY231908qRT-PCR ToTNF-αF: GGCGTCGTTCAGAGTCTCCT R: TCCTCCTGGGCAGTGGTTT [24]qRT-PCR EF-1α
F: CCCCTTGGTCGTTTTGCC
R: GCCTTGGTTGTCTTTCCGCTA
[22]
内参
图1 卵形鲳鲹肠道微生物稀释曲线 (a) 和Rank abundance 曲线 (b) (n =9)
Figure 1 Rarefaction (a) and Rank abundance (b) curve of intestinal microbial diversity of T. ovatus
三个人一双眼睛90南 方 水 产 科 学
第 17 卷
越接近的样本，表示物种组成结构越相似，结构相似度高的样本倾向于聚集在一起；主成分 (PCoA)和无度量多维标定法 (NMDS) 分析显示，T1、T2和T3组倾向于聚集在一起，物种相似度较高；T1和T4组间样品距离较远，倾向于离散分布，物种组成结构相似度较低。
2.1.4 肠道菌组成及其相对丰度分析 卵形鲳鲹在门水平肠道菌组成及其相对丰度见图4，所有试验组肠道微生物菌在门水平上主要注释到10个门和其他的未知微生物体，占据主导地位的主要包括变形菌门、软壁菌门、螺旋体门。T0—T4组变形菌门相对丰度分别为19.6%、11.6%、10.8%、28.1%、41.1%。T0—T4组软壁菌门相对丰度分别为45.1%、60.4%、56.9%、3
3.2%、37.0%；T0—T4组螺旋体门相对丰度分别为23.0%、6.4%、12.8%、23.8%、
4.1%。T0—T4组拟杆菌门相对丰度分别为1.5%、12.4%、8.7%、
5.1%、4.2%。肠道菌组成及相对丰度分析显示，随饲料外源牛磺酸含量的增加，试验组变形菌门、软壁菌门、螺旋体门和拟杆菌门的相对丰度出现显著性变化，TI和T2组变形菌门相对丰度较T0组分别减少了8.0%和8.8% (P<0.05)；T1和T2组软壁菌门相对丰度较T0组分别增加了15.3%和11.8% (P
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<0.05)；T1、T2和T4组螺旋体门相对丰度较T0组分别减少了1
6.6%、10.2%和18.9% (P<0.05)；T1和T2组拟杆菌门相对丰度较T0组分别增加了10.9%和
7.2% (P<0.05)。卵形鲳鲹在属水平肠道菌组成及其相对丰度见图5，占据主导地位的主要包括支原体菌属、短螺旋体属和甲基杆菌属。T3和T4组支原体菌属相对丰度较T0组分别减少了17.4%和5.6% (P<0.05)；T2和T3组短螺旋体属相对丰度较对照组分别增加了13.7%和12.2% (P<0.05)；T2、T3和T4组甲基杆菌属相对丰度较T0组分别增加了3.3%、1.7%和1.4%。
图2 牛磺酸对卵形鲳鲹肠道微生物Alpha多样性分析 (n=9)
*. 差异显著 (P<0.05)；**. 差异极显著 (P<0.01)
Figure 2 Alpha diversity analysis of intestinal microbial diversity of T. ovatus
*. Significant difference (P<0.05); **. Very significant difference (P<0.01)
第 2 期马启伟等: 牛磺酸对卵形鲳鲹肠道微生物及免疫功能的影响91
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