作者简介：窦会娟（1977-），女，硕士，副教授，从事微生物生态学方面研究，Email：douhj106@163．com
通讯作者：窦会娟·综述·
窦会娟，郭文涛，王婷婷，李林珂
漯河医学高等专科学校，河南漯河462000
摘要：肠道正常微生物在平衡人体健康和疾病的过程中起着重要作用，如何对肠道菌的丰度与数量变化进行全面分析是开展肠道微生态研究的瓶颈问题。通过查阅大量资料，总结了当前肠道菌研究常用的方法及每种方法的优缺点，为进一步深入进行肠道微生态方面的研究提供参考。 关键词：肠道菌；分离培养技术；基因检测技术；质谱技术 中图分类号：Ｒ378文献标志码：A文章编号：1005-376X（2014）01-0119-03
DOI编码：10．13381/j．cnki．cjm．201401032
Progress on the research technology of intestinal flora
DOU Hui-juan，GUO Wen-tao，WANG Ting-ting，LI Lin-ke
Luohe Medical College，Luohe462000，China
Corresponding author：DOU Hui-juan，Email：douhj106@163．com
Abstract：Intestinal microorganisms play an important role in the maintenance of human health and prevention of disease．It is very important to analyze the intestinal flora well for further researches．Based on a number of refer-ence literatures，we summarized most of the methods used in studying the intestinal flora，as well as the advantages and disadvantages of each method，in order to provide useful reference for further studies on gut microflora．
城市乌托邦Key words：Intestinal flora；Isolation and culture；Genetic testing；Mass spectrometry
人体肠道中的微生物有1000多种，总重量大约为1．0 1．5kg，总数在1014个以上，相当于人体所有组织细胞总数的10倍。肠道正常微生物在平衡人体健康和疾病的过程中起着重要作用［1］，肠道微生物落及其对人类健康的影响近年来已成为广受关注的热点。肠道菌分析是进行复杂微生态系分析的基础，如何对肠道菌丰度与数量变化进行全面分析是开展微生态研究的瓶颈问题。现将肠道菌
研究方法的进展做一综述，方便肠道微生态研究者进行参考。
1基于分离、培养的方法
该方法一般是采用各种选择性培养基培养细菌，将各种细菌分离并根据染、生化反应及血清学实验等方法对细菌进行鉴定，同时可进行倍比稀释和菌落计数来测定活菌数量。此方法比较成熟，依然被许多进行肠道菌的研究者采用。例如陈琛等［2］研究了中草药对小鼠肠道的影响，在研究中采用分离培养、生理生化鉴定的的方法鉴定出了小鼠肠道菌中的乳杆菌、双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌。李建婷等［3］采用选择性培养基分离培养细菌，研究了王氏保赤丸对小鼠肠道菌的影响。O'Keefe等［4］发现7α-去羟化菌在结直肠癌高风险人肠道菌中的比例显著高于低风险人，而植物乳酸杆菌（Lactobacilli plantarum）在高风险人肠道菌中的比例则显著低于低风险人。
对环境中获得的细菌菌株进行培养有助于全面、完整地研究细菌的功能和不同生长条件下的生理活性。例如，Falony等［5］以果寡糖为唯一碳源，将长双歧杆菌株（Bifidobacterium longum）BB536分别与来源于人体肠道的丁酸盐产生菌株Anaerostipes caccae DSM14662和Ｒoseburia intestinalis DSM14610进行共培养，发现了这些细菌之间两种不同的交叉互养（Cross-feeding）模式，作者提示，这些行为的揭示有助于理解肠道微生态系统中各种细菌对营养成分的利用情况和各种细菌之间的互作。但自然界中有90% 99%的微生物用传统方法无法培养出来，因此该方法只能对部分的菌进行分析，而且耗时。
潘广田对于种类、数量如此巨大的肠道微生态系而言，只对部分菌进行分析不够全面，也不能反映整个微生态系与疾病发生发展的关系，分析的结果与结论有一定局限性［6］。
2基因检测方法
对于用分离培养方法不能检测的微生物，基因检测更显优势，常用的有基于分子杂交技术的分析方法、基于DNA指纹图谱的分析方法、基于DNA 测序的检测方法。
2．1基于分子杂交技术的分子标记法基于分子杂交技术的分子标记法，如荧光原位杂交、基因芯片技术等，可对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性。
2．1．1荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）该方法是将经过处理后的细胞固定在载玻片上，用有荧光标记的寡核苷酸探针直接与之进行杂交，杂交过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸，用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞［7］。该方法优点是在保持组织结构和细胞的原貌情况下能特异性显示检测目标与组织细胞的结构关系，因此能在研究肠道细菌之间、肠道细菌与肠道组织的结构功能关系方面具有不可替代的优势。
2．1．2基因芯片技术基因芯片又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）。其原
理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上，然后加入标记的待测样品，进行多元杂交，通过杂交信号的强弱及分布，来分析目的分子的有无、数量及序列，从而获得受检样品的遗传信息。基因芯片能够同时平行分析数万个基因，进行高通量筛选与检测分析，解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足。利用肠道细菌16S rＲNA基因作为检测的靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸探针以制备基因芯片，可以通过杂交反应来检测肠道菌。徐晓静等［8］利用16S rＲNA的恒定区和可变区设计制备的基因芯片在4h 内就能完成沙门菌属、志贺菌属、葡萄球菌属和耶尔森菌共4个菌属的23株肠道菌及相关细菌的杂交检测，每种细菌均呈现出具有各自特征的杂交结果，而且无其他探针产生阳性信号。
2．2基于DNA指纹图谱的分析方法DNA指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物落中各物种的DNA分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示落的组成结构。DNA指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物落结构的动态变化或比较不同落之间的结构差异。最常用的DNA指纹图谱技术有随机扩增多态性DNA技术（random amplified polymorphic DNA，ＲAPD）、扩增片段长度多态性技术（amplified restriction fragment-polymorphism，AFLP）、限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，ＲFLP）和末端限制性片段长度多态技术（terminal r
estriction frag-mentlength polymorphism，T-ＲFLP）、单链构象多态性技术（single-strand conformation polymorphism，SS-CP）、变形梯度凝胶电泳（DGGE）、核糖体基因间区分析（ribosoma lintergenic spacer analysis，ＲISA）等。
近年来，16S rDNA的分子生物学技术大大促进了微生态研究的发展，特别是变性梯度凝胶电泳技术（DGGE），该技术利用含有变性剂（尿素和去离子甲酰胺）梯度的聚丙烯酰胺凝胶把相同长度但序列不同的DNA片段分离开来，并且能有效分析复杂微生物落及其多样性且无须培养微生物。在上世纪70年代末Fischer和Leman首次提出了DGGE技术，并把它用到医学上基因点突变的检测中，该技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列，可以分析微生物落中优势类或独特种的遗传多样性，被广泛应用在微生物多样性和种差异上，避免了传统微生物研究方法的局限性；DGGE还可以单独对胶中所感兴趣的条带进行分析研究，得到其序列可直接获得和该系统生态功能相关的微生物种系统进化信息［9］。
2．3基于DNA序列测定的研究方法不同于指纹图谱技术，DNA测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法，对落中各物种的进化地位作出判断。目前，几乎所有已知细菌的16S rDNA碱基序列已被测定并存入基因库。在肠道菌的研究中，扩增产物经纯化后可直接进行测序或通过TA 载体建立16Sr DNA基因文库再进行全序列分析。所得序列可通过（GenBank、EMBL、DDBJ、ＲDP及The EuropeanＲibosomalＲNA Database，ht tp：//rrna．uia．ac．be/ssu/）等数据库进行序列比较（用
BLAST 程序）来确定其种、属。并根据序列的同源性，计算不同物种之间的遗传距离，然后采用聚类分析等方法，将细菌进行分类，并将结果用系统发育树（phylogenetic tree）表示。但序列测定相对费用较高，且全序列分析法不能进行准确的定量，只能定性得出菌组成的多样性，而且核酸的分离、目标片段
扩增、基因文库的构建和全部序列测定整个过程周期长、工作量大。故在实际工作中常常与前述的DNA指纹图谱技术相结合，在用DNA指纹技术初筛后对某些特定条带进行基因克隆、测序，再对所得到的序列进行分析。
应用DNA指纹图谱技术的方法来分析肠道菌极大地提高了目标菌鉴定的灵敏性和特异性，但是分析的前提必须是已知基因的微生物。所以，肠道菌的研究和分析由于手段的限制，尚未能真实全面地反映肠道菌的生存状态。2010年Qin等［10］初步完成了对肠道菌基因的测序，这一结果虽然使人类在向肠道菌的研究推进了一大步，但目前在全球范围内对肠道菌丰度与数量准确变化的方法仍没有突破。
3质谱技术
随着人类基因组框架的明确，生物大分子尤其是蛋白质成为生命科学的重点，越来越多的研究者意识到有必要从蛋白质水平来研究微生物。蛋白质是细菌功能的执行者，细菌种类繁多，不同的蛋白种类咪唑啉
决定细菌千变万化的功能和特征。基于对菌体蛋白质分析的质谱技术具有在复杂体系中同时区分不同蛋白组分的特点，为肠道菌种类的快速、准确、高通量的鉴别提供了可靠方法［11］，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱（MALDI-TOF）是21世纪出现的一种新型飞行质谱技术，是研究菌体表达蛋白的有力工具。该技术检测的原理是将微生物样品与等量的基质溶液混合后或分别点加在样品板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶体，利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质从激光中能量使样品发生解吸，基质与样品之间发生电荷转移使样品分子电离，经过飞行时间检测器，将检测到的离子峰为纵坐标，离子质荷比（m/z）为横坐标，形成指纹图谱，通过软件进行分析比较，筛选并确定出特异性峰及图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定。Marinach-Patrice等［12］对人类血液样品进行血培养，对其阳性的样品用MALDI-TOF-MS法对其中的白念球菌进行种的分类，结果准确，可以替代传统的传代再鉴定。Hsieh等［13］将6种不同的菌种混合，应用MALDI-TOF-MS鉴定，在细菌的蛋白指纹图中发现菌种的特异蛋白峰，根据蛋白峰m/z 的不同，将六种不同的菌种区分开。三星w539
采用质谱技术可以区分不同状态下肠道菌的蛋白图谱，但该方法受到样本处理方法以及分析方法的影响，目前还不是太成熟。参考文献
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收稿日期：2013-11-13修回日期：2013-12-11
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