- 概述
- 16S测序实验流程
aod- 16S分析流程
- 结果怎么看
- 常见问题
- 参考⽂献
概述
你知道吗？居住在我们肠道内的细菌数量，是⼈体细胞总数的10倍之多！我们每天排出的粪便中，50%以上的⼲重量是由这些细菌及其“⼫体”构成的。因此有⼈打趣的说，从数量上来看，我们⼈类并不应该被称为⼈类，⽽应被称作细菌。如此庞⼤的细菌体驻扎在肠道内，构成了⼀个极为复杂的体，被称作肠道菌。肠道菌被认为与⼈类健康息息相关，据估计，每个⼈的肠道菌可包括～500种细菌。
那么，如何鉴别肠道菌的种类和丰度呢？实验室常⽤的研究⽅法主要有哪些呢？
常规的基于分离培养的⽅法，该⽅法较为成熟，依然被许多肠道菌的研究者采⽤，但是肠道菌⼤多不能培养且⽐较耗时耗⼒，⽆法全⾯的分析对于种类和数量巨⼤的肠道微⽣态系统；
质谱技术，基于对菌体蛋⽩质分析的质谱技术具有在复杂体系中同时区分不同蛋⽩组分的特点，为肠道菌的快速、准确、⾼通量的鉴别提供了可靠⽅法；
图书管理系统对于不容易分离培养的微⽣物，基因检测更显优势，常⽤的有基于分⼦杂交技术的分析⽅法、基于 DNA 指纹图谱的分析⽅法、基于 DNA 测序的检测⽅法等。
近年来，随着⾼通量测序技术的发展，16S rRNA基因测序技术在细菌的鉴定与分类研究中发挥着越来越重要的作⽤。
16S rRNA基因普遍存在于细菌细胞，在细菌基因组中位于核糖体⼩亚基（约1540 bp），该区域兼顾保守性和⾼变性，含有10 个保守区域(Conserved Regions)和 9 个⾼变区域(variable Regions)，保守区可⽤于设计引物进⾏⽬的⽚段的扩增，⽽通过对⾼变区的分析可以辨别细菌种类。因此，16S rRNA基因被认为是最适于细菌系统发育学研究和物种分类鉴定。⽬前⽤于16S rRNA基因深度测序的区域主要有V4区，V3-V4区、和V4-V5区等。 16S测序实验流程
将检测合格的环境微⽣物DNA样本对其指定区域进⾏PCR扩增、⽂库制备、⽂库质检、定量，使⽤设定的TAG序列进⾏样本区分。采⽤Illumina Hiseq 2500⾼通量测序平台对检测合格的⽂库进⾏测序。实验流程如下图所⽰： 16S分析流程
16S分析流程主要包括：Hiseq/Miseq测序获得的Paired-end (PE) reads拼接成⼀条序列，对⽬标序列进⾏质控过滤，过滤后的序列与参考数据库作⽐对，去除嵌合体序列得到最终得优化序列。基于优化序列进⾏OTU聚类分析和物种分类注释，基于OTU聚类结果进⾏多样性指数分析，基于分类学信息进⾏物种结构分析和物种差异分析。
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数据质控与优化
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数据质量评估
根据Fastq⽂件对测序样品进⾏数据质量评估（可以参考⽣信⼊门：Fasta与Fastq格式⽂件详解详细了解fastq⽂件）。单个样品的碱基质量分布如下图所⽰：
注：横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基平均Phred值。前250bp 为双端测序序列的Read1的碱基质量值分布情况，后250bp为read2 的碱基质量值分布情况。
也可以使⽤⼀⽂搞定细菌基因组De Novo测序分析中提到的fastqc和fastp进⾏质控。
如果想确定拿到⼿⾥的序列fastq序列就是16S的⼀部分，⽽不是其他的神马⿁，可以在NCBI的blast上⽐⼀⽐（可参考⽣信⼊门：序列⽐对之blast在线和本地使⽤）。
序列拼接
根据PE reads之间的overlap采⽤Flash软件对数据进⾏拼接。
数据过滤
由于测序过程中会引⼊错误或者不可靠碱基，严重影响后续分析结果准确性。因此，采⽤fastx-toolkit⼯具过滤数据，只保留⾼质量（Q值>=25）的碱基⽐例⼤于等于90%的reads。
嵌合体序列检测
嵌合体在遗传学上⽤以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。嵌合体序列的出现会导致测序结果中产⽣⼀些实际并不存在的核酸序列，影响结果的可靠性。
因此，可以⽤usearch 64-bit软件进⾏嵌合体序列的检测及过滤。
usearch 64-bit是收费的，主要优势是⽀持⼤内存处理海量数据，它是超快的序列分析软件，在序列⽐对、聚类、操作等多领域⼴泛应⽤。
OTU聚类及物种注释
OTU（Operational Taxonomic Units，操作分类单元）是在系统发⽣分析或体遗传研究中的⼀个假定的分类单元，通过⼀定的距离度量⽅法计算两两不同序列之间的距离度量或相似性，继⽽设置特定的分类阈值，获得同⼀阈值下的距离矩阵，进⾏聚类操作，形成不同的分类单元。
东方直播室2012OTU聚类的⽬的：
1. 每个OTU（97%）在级别上对应⼀个种/属；
2. 每个OTU挑选出⼀个代表序列参与后续分析，节约计算资源；
3. 减少PCR或测序过程中引⼊的错误（错误序列与其来源序列较为相似，会聚成⼀个OTU）。
OTU聚类分析
OTU聚类部分结果如下表所⽰：
物种结构分析
统计所有样本在门、纲、⽬、科、属各层次上的分类结果。基于丰度前⼗五的物种采⽤累积柱状图⽐较样本间的物种组成差异，并进⾏列表展⽰。全样本在门层次的落结构分析结果如下图所⽰：
物种丰度聚类热图
基于属⽔平上每个样品的物种丰度信息，选取丰度前50的属，根据各样品的丰度信息对样品和物种进⾏聚类，绘制热图。便于观察样品对应物种含量得⾼低。结果如下图所⽰：戒瘾
单样本多级物种组成图
利⽤KRONA软件对物种注释结果进⾏可视化展⽰，圆圈图得各层依次代表物种得分类级别，扇形的⼤⼩代表注释物种的⽐例。
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