范丽萍 沈建箴 叶宝国 林福安 傅海英 周华蓉 沈松菲 喻爱芳
【摘要】 为了研究p16基因甲基化和缺失与急性白血病发病的关系，探讨其在成人急性白血病发生进展中的生物学意义，应用巢式甲基化特异性聚合酶链反映（nested methylation specific polymerase chain reaction，n MSP）分析了82例各类亚型的急性白血病患者在初诊或复发不同时期p16基因的甲基化和缺失状态，而且在基因组硫化修饰PCR后克隆测序验证结果的准确性。结果说明: 82例急性白血病（AL）患者p16基因甲基化的显现率为％,其中急性髓系白血病(AML)患者为％,24例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者为％；初治AL患者为％，而复发患者那么为％。82例AL患者中有6例p16基因缺失，缺失率为%，在AML、ALL患者中别离为％和％。16例健康志愿者或非恶性血液病患者p16基因那么未发生甲基化或缺失。结论:在成人急性白血病的发生进展中，p16基因甲基化比p16基因纯合缺失更具成心义；p16基因表达异样与成人急性白血病的发生进展紧密相关。
【关键词】 p16基因; 基因甲基化; 急性白血病; n MSP
左旋肉碱论坛 Detection of p16 Gene Methylation Status in Adult Patients with Acute Leukemia by Using n山东高速公路网 北京贵宾犬MSP
Abstract The study was aimed to explore the relationship between patterns of methylation or deletion and the development of acute leukemia, and further to clarify the possible mechanism in the development of adult acute leukemia. Nested methylation specific polymerase chain reaction (n MSP) was adopted to analyze p16 gene methylation or deletion patterns in 82 adult acute leukemia patients with different subtypes and stages. The results indicated that rate of p16 gene methylation was % in 82 adult acute leukemia patients, among them, % in acute myelogenous leukemia (AML) and % in acute lymphoblastic leukemia(ALL).It were found that ％of de novo AL patients and % of relapsed AL patients developed the hypermethylation of p16 gene. Out of the 82 patients， 6 seemed to have deletion of p16 gene, including 1 AML（％） and 5 ALL％). There were no hypermethylation or deletion of p16 gene in the 16 controls. It is concluded that methylation of p16 gene may play a more important role than homozygous deletion of p16 gene in the leukemogenesis and progression of adult acute l
eukemia．
Key words p16 gene; gene methylation; acute leukemia; n MSP
雷锋精神伴我成长 p16基因由Kamb于1994年在对近300株细胞进行检测时发觉［1］，它位于染体9p21，其编码产物P16蛋白属于CKI中的INK4家族，通过与cyclin D竞争与CDK4、6的结合而在细胞周期调控中发挥着重要的负调控作用。传统的观点以为，基因的缺失和突变是基因失活的要紧方式；最近几年来研究显示，基因甲基化所致使的基因沉默亦是基因失活的方式之一，在多种恶性血液病中，p16基因发生异样的要紧途径是基因缺失和基因异样甲基化。目前分析DNA甲基化最经常使用的方式是甲基化特异性PCR（MSP）， 在这种方式的基础上诞生的改良方式即巢式甲基化特异性PCR（nMSP）具有更高的灵敏度和特异性，能够检测出1/50 000的甲基化等位片段［2］,很适合用于 p16 基因启动子区甲基化的检测。
材料和方式
一棵树上的两种果实 标本的搜集
福建医科大学附属协和医院和漳州市医院收治的急性白血病患者共82例，男性49例，女33
例，中位年龄(14-74)岁。其中急性髓系白血病(AML)58例（包括49例初治和9例复发）,急性淋巴细胞白血病(ALL)24例（包括22例初治和2例复发）。所有病例均符合急性白血病的诊断标准［3］。对照组16例（包括10例健康志愿者和6例非恶性血液病患者）。搜集患者和对照者的骨髓和外周血标本。
试剂和仪器
蛋白酶K、RNA酶、DNA修饰药物亚硫酸氢钠，氢醌（对苯二酚）等试剂购自Sigma公司，淋巴细胞分离液、酚 氯仿DNA抽提液为上海生物工程公司产品，Wizard DNA树酯纯化柱为Promega公司产品， DNA Marker 1购自厦门泰晶生物，一般热启动Taq为酶TaKaRa公司产品。所用仪器:37℃、饱和湿度、5% CO2培育箱（Heal Force）、2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems,Version ）、紫外分光光度仪(美国贝克曼公司产品，DU 640型)、凝胶成像仪(BIO RAD公司产品，Gel Doc 1000型)。
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