668中国骨质疏松杂志 2021年5月第27卷第5期 Chin J Osteoporos , May 2021 , Vol 27 , No. 5
Published online www.wanfangdata doi : 10. 3969/j.issn.1006-7108. 2021. 05. 009
王剑1丰雪妮1刘剑辉1谢剑1刘文艳1张景云1宋光熠1郑洪新2*
基金项目：辽宁省科学事业公益研究基金项目(GY-2018-0033)* 通信作者：郑洪新，Email ：*******************
1. 辽宁省基础医学研究所，辽宁沈阳110101
2. 辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847
中图分类号： R965 文献标识码： A 文章编号： 1006-7108( 2021) 05-0668-06
摘要：目的 观察去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Leptin 启动子甲基化，探索补肾健骨中药复方防治绝经后骨质疏松症 (postmenopausal osteoporosis,PMOP )的分子机制。方法 切除雌性Wistar 大鼠双侧卵巢建立PMOP 模型，实验大鼠分为4组：正
常组、模型组、补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组。给药14周后,X 射线骨密度测定仪检测骨密度、显微镜观察股骨头 石蜡切片HE 染显微形态结构、质谱法检测Leptin 启动子甲基化。结果 ①第1-6腰椎骨密度，模型组与正常组相比显著降
低(P<0.01)；补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模型组相比显著升高(P<0.05)。②模型组与正常组相比，股骨头骨
皮质骨板变薄，骨松质骨小梁明显变细，有些部位破坏、断裂，骨髓腔明显扩大；补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模
型组相比，股骨头显微形态结构病理改变明显改善。③骨组织Leptin 启动子-493 bp--19 bp 甲基化水平，模型组与正常组相比 CpG19、CpG22. 23显著升高(P<0.05)；补肾健骨中药复方组(P<0.01)、仙灵骨葆阳性对照组(P<0.05)与模型组相比,CpG19甲 基化水平显著降低。结论 补肾健骨中药复方通过降低骨组织Leptin 启动子甲基化的分子机制，有效防治PMOP 。
关键词：绝经后骨质疏松症；补肾健骨中药复方;Leptin ；甲基化；中医中药
Effect of reinforcing kidney to strengthen bone Chinese herbal compound on methylation of leptin promoter in bone of ovariectomized osteoporosis rats
WANG Jian 1, FENG Xueni 1 , LIU Jianhui 1, XIE Jian 1, LIU Wenyan 1, ZHANG Jingyun 1, SONG Guangyi 1, ZHENG Hongxin 2*
1. Liaoning Institute of Basic Medicine ， Shenyang 110101
2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine ， Shenyang 110847， China
* Corresponding author ： ZHENG Hongxin ， Email ： zhenghx2002@ 126
Abstract ： Objective To observe the methylation level of leptin promoter in bone of ovariectomized osteoporosis rats ， and to
explore the molecular mechanism of reinforcing kidney to strengthen bone Chinese herbal compound in preventing and treating
postmenopausal osteoporosis ( PMOP) . Methods PMOP model was established by ovariectomy in Wistar rats. Rats were divided into 4 groups ： normal group ， model group ， reinforcing kidney to strengthen bone Chinese herbal compound group ， and
Xianlinggubao positive control group. After 14 weeks of drug administration ， bone mineral density was detected with X-ray
absorptiometry. Micro-morphology structure of HE stained paraffin section of the femoral head was observed with the microscope. Leptin promoter methylation level was detected with MassARRAY. Results (1) Bone mineral density of the lumbar vertebrae 1
6 decreased significantly in model group compared to that in normal group (P <0.01) and increased significantly in reinforcing
kidney to strengthen bone Chinese herbal compound group and Xianlinggubao positive control group compared to that in model group (P<0. 05). (2) Compared to those in normal group , the cortical bone plate of the femoral head in model group became thinner , the
cancellous bone trabeculae became obviously thinner with damage and fracture at some parts ， and the bone marrow cavity was enlarged obviously in model group. The pathological changes of micro-morphology structure of the femoral head improved obviously
in reinforcing kidney to strengthen bone Chinese herbal compound group and Xianlinggubao positive control group compared to those in model group. (3) The methylation level of leptin promoter - 493 bp - - 19 bp CpG19 and CpG22. 23 in bone increased
significantly in model group compared to that in normal group(P<0.05).The methylation level of leptin promoter-493bp----19 bp CpG19in bone decreased significantly in reinforcing kidney to strengthen bone Chinese herbal compound group(P<0.01)and Xianlinggubao positive control group(P<0.05)compared with that in model group.Conclusion Reinforcing kidney to strengthen bone Chinese herbal compound reduces leptin promoter methylation in bone to prevent and treat PMOP effectively.
Key words:postmenopausal osteoporosis；reinforcing kidney to strengthen bone Chinese herbal compound；leptin；methylation；traditional Chinese medicine
绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PM0P)是女性绝经后雌激素水平下降导致的高转换型骨质疏松，严重影响绝经后女性的生活质量。近年研究显示，主要由脂肪细胞合成、分泌，参与调节糖、脂及能量代谢的肽类激素一瘦素(Leptin,LP)亦表达于骨组织，与骨代谢密切相关［1］,DNA甲基化可调控骨代谢相关基因的表达，影响骨质疏松的发生、发展［2-3］。本研究基于骨组织Leptin启动子甲基化水平，探索PM0P发病以及“肾主骨”理论指导之补肾健骨中药复方疗效的分子机制，为中医药防治PM0P 提供实验依据。
1材料与方法
1.1动物
SPF级Wistar大鼠(许可证号:SCXK［辽］2015-0001，辽宁长生生物技术股份有限公司)61只,3月龄，雌性未交配，体重(240±20)g。大鼠饲养于室温20T〜25T、湿度35%〜65%的基础所药理动物室，以辽宁长生生物技术股份有限公司提供的大小鼠维持饲料饲喂。
1.2分组与造模
随机分出12只大鼠为正常组，余者腹腔注射3%钠麻醉(35mg/kg)后，经腹部切口完整切除双侧卵巢。随机将术者分为模型组、补肾健骨中药复方组和仙灵骨葆阳性对照组，分别为12只、18只、19只。仙灵骨葆阳性对照组灌胃期间死亡1只。
1.3药物
补肾健骨中药复方(由辽宁宏宇生物科技有限公司提供的鹿茸冻干粉、四川新绿药业科技发展有限公司提供的淫羊藿颗粒和产于长山岛大连湾、制成平均粒径780nm的牡蛎壳微粉组成)；仙灵骨葆胶囊(由国药集团同济堂［贵州］制药有限公司生产，批号180417，国药准字Z20025337，成分：淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄)。
1.4剂量与给药方法
补肾健骨中药复方组和仙灵骨葆阳性对照组给药剂量按成人6.3倍计算，分别给补肾健骨中药复方［鹿茸0.315g/(kg-d)、淫羊藿0.15g/(kg-d)、牡蛎1.05g/(kg-d)］和仙灵骨葆胶囊粉0.315 g/(kg-d)，给药体积：1mL/100g。正常组和模型组给等体积生理盐水。术后6d开始灌胃，1次/d (灌胃6d，停灌1d)，给药14周。
1.5取材
末次灌胃给药后，禁食24h，取第1-6腰椎，生理盐水冲洗，医用纱布包好，再以锡纸包于其外，保存在-80°C冰箱内，待检测骨密度；取股骨头，10%福尔马林溶液固定，待做石蜡切片HE染；取股骨头，装入液氮冻存管，先以液氮速冻，再保存在-80 C冰箱内，待检测甲基化。
1.6指标检测
1.6.1骨密度(bone mineral density,BMD)：用X射线骨密度测定仪(STRAT0S DR,Diagnostic Medical System SA，法国)检测第1-6腰椎骨密度。
1.6.2骨组织显微形态结构：10%硝酸脱钙制作股骨头脱钙石蜡切片，HE染，0LYMPUS BX51显微镜(日本)观察骨组织形态结构并拍照(400倍)。1.6.3Leptin启动子甲基化：质谱法检测：由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。检测片段：Leptin基因启动子-493bp—19bp，长度475bp, CpG位点总数2
7个，能检测到26个CpG位点。①引物设计：Leptin修饰后的上游引物：aggaagagagGGGTATTAAAGGATAGTTTTTGTTTTG，修饰 后的下游引物：cagtaatacgactcactatagggagaa ggctACTCCATACCTACCTACCCCTCTTA。②使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,51304)提取骨组织DNA。③使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYM0, D5005)、PCR仪(96孔,BI0RAD)对DNA样品进行重亚硫酸盐处理。④使用PCR Accessory Set (SEQUEN0M,11327)和步骤①设计、合成的引物、S1000TM Thermal Cycler(384孑L,BI0RAD)扩增重亚硫酸盐处理后的样品。⑤使用MassCLEAVE Kit (SEQUEN0M,10129.1)、S1000TM Thermal Cycler (384孔,BI0RAD)对步骤④的PCR产物进行碱性磷酸酶处理(SAP)。⑥使用MassCLEAVE Kit
(SEQUENOM,10129.1)、S1000TM Thermal Cycler (384孑L,BIORAD)将SAP处理后的PCR产物进行体外转录和RNase酶切。⑦使用Spectro CHIP©Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM,10117)、MassARRAY Nanodispenser(RS1000,SEQUENOM)将酶切产物纯化、点样、质谱分析。
1・7统计学分析
采用SPSS18.0软件进行统计学分析，数据以疋±$表示，选用one-way ANOVA进行组间比较，P< 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠离体第1-6腰椎骨密度
模型组与正常组相比，骨密度显著降低(P< 0.01)；补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模型组相比，骨密度显著升高(P<0.05)。见表1表1各组大鼠离体第1-6腰椎骨密度（无土s）
Table1BMD of the rat lumbar vertebrae1-6in each group （无土s）
组别n第1-6腰椎骨密度/(附cm2)
正常组120.2234±0.0550AA
模型组120.1543±0.0328**
补肾健骨中药复方组180.1949±0.0471A
仙灵骨葆阳性对照组180.1864±0.0268*a 注：与正常组相比：*P<0.05,**P<0.01；与模型组相比：△P< 0.05,△△P<0.01。
2.2各组大鼠股骨头显微形态结构
与正常组比较，模型组骨皮质骨板变薄，骨松质骨小梁明显变细，有些部位破坏、断裂，骨髓腔明显
扩大；与模型组比较，补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组上述病理改变均明显改善。见图1。
图1各组大鼠股骨头石蜡切片HE染显微形态结构(400倍)
Fig・1Micro-morphology structure of HE stained paraffin section of the femoral head of rats in each group（400times）
2.3各组大鼠骨组织Leptin启动子-493bp—19 bp甲基化
Leptin基因启动子-493bp—19bp检测片段含有27个CpG位点，位点6未检测到。图2、表2显示：与正常组比较，模型组CpG19、CpG22.23甲基化水平显著升高(P<0.05)，其余位点甲基化差异不显著。与模型组比较，补肾健骨中药复方组(P< 0.01)、仙灵骨葆阳性对照组(P<0.05)CpG19甲基化水平显著降低，其余位点甲基化差异均不显著。
3讨论
中医理论认为肾为先天之本，藏精生髓主骨。肾精充盛、生髓有源、骨得濡养而强劲有力；肾虚精亏、生髓乏源、骨失濡养而痿弱无力，发为骨质疏松。女子七七天癸竭，肾虚精亏，髓减骨枯，而引发绝经后骨质疏松症。故PMOP的根本病机是肾虚，临床防治该病应补肾以健骨。
近年对骨质疏松的研究偏重表观遗传，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、染质重塑等［4-5］，其中DNA甲基化的研究颇受青睐。DNA甲基化是DNA甲基转移酶催化甲基转移至DNA分子CpG的胞嘧啶上，甲基化基团阻止转录因子结合调控序列，抑制基因转录，调控骨代谢相关基因的表达，影响骨质疏松的发生、发展［2-3］。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)家族中诱导成骨分化效应最强的BMP9启动子甲基化下调其表达⑹。成骨重要基因Runx2、骨钙素表达升高与相应启动子甲基化降低密切相关⑺。抑制DNA甲基化会使成骨特异基因Osterix表达［8］。激活后可促进成骨细胞分化、增殖的PI3K/AKT信号通路的PIK3AP1启动子高甲基化下调其表达［9］。左归丸含药血清下调Runx2、0sterix甲基化，促进骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化［10］。课题组同期研究表明，去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Dlx5、Runx2、Osterix启动子甲基化水平明显升高，补肾中药复方(鹿茸、淫羊藿、牡蛎，功效为补肾填精、益髓壮骨)通过降低骨组织Dlx5、Runx2、Osterix启动子甲基化，有效防治PM0P［11-12］o
瘦素由肥胖基因编码、主要由脂肪细胞合成，是蛋白质类激素，分泌入血运送至靶器官，通过结合瘦素受体发挥生物学效应，参与调节糖、
脂及能量代
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模型组
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200 225 250 2750% ••••©©OODC WO% Not analyzed Leptin-16
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补肾健骨中药复方组
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图2骨组织Leptin 基因启动子-493 bp- -19 bp 各CpG 位点甲基化程度图谱
Fig ・2 Methylation degree map of leptin gene promoter -493 bp ----19 bp CpG sites in bone
谢［13］。近年研究显示，瘦素亦表达于骨组织，与骨 代谢密切相关⑴，可能为骨质疏松的防治提供新的 靶点。研究显示，瘦素可增加BMSCs 表达碱性磷酸
酶、骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子a1，促进其成 骨分化［14-16］o 瘦素可上调I 型胶原蛋白表达，促进 骨形成［⑺。雌性瘦素基因缺乏鼠，皮下注射瘦素可
显著促进其腰椎及股骨干骺端骨形成［18］。温阳通
络方可明显升高去卵巢联合氢化可的松造模的肾阳
虚证大鼠血清瘦素水平而有效增加其骨密度［19］。 补肾健脾方可上调大鼠血清和骨组织中瘦素、瘦素
受体的表达，改善骨代谢，防治原发性骨质疏松 症［20］。课题组前期研究表明［21-22］，去卵巢骨质疏松
症大鼠下丘脑Leptin 蛋白水平显著升高、骨组织 Leptin 蛋白表达显著降低；补肾中药复方（鹿茸、淫
羊藿、牡蛎，功效为补肾填精、益髓壮骨）可降低下
丘脑 Leptin 蛋白水平、 上调骨组织 Leptin 蛋白表达，
有效防治PM0Po
研究显示，甲基化负调控瘦素基因表达［⑼。那
么，骨质疏松症的发病以及药物的作用靶点是否与
瘦素基因甲基化调控机制有关呢？本实验摘除雌性
大鼠双侧卵巢建立经典的PM0P 模型［24］，以骨组织 Leptin 基因启动子-493 bp — 19 bp 甲基化水平为
效应指标，探究PM0P 发病和中医“肾主骨”理论指
导下的补肾健骨中药复方（以补肾生精、强筋健骨 之鹿茸为君药；以温补肾阳、强筋健骨之淫羊藿为臣 药；佐以补肾壮骨、滋阴潜阳之牡蛎，全方共奏补肾
填精、生髓健骨之功）防治PM0P 的分子机制，以仙 灵骨葆胶囊为阳性对照药（功效为滋补肝肾、
接骨
表2各组大鼠骨组织Leptin基因启动子-493bp--19bp甲基化水平(^±s)
Table2Methylation level of leptin gene promoter-493bp--19bp in bone of rats in each group（无土s）
CpG Unit位点正常组(n=6)模型组(n=6)补肾健骨中药复方组(n=6)仙灵骨葆阳性对照组(n=7) CpG1.20.5167±0.03980.4833±0.03560.4950±0.04280.5114±0.0353 CpG30.5717±0.02140.5783±0.04490.5750±0.01050.5657±0.0276 CpG4.50.2617±0.04750.2367±0.03720.2567±0.01970.2643±0.0465 CpG70.2883±0.08040.3050±0.08460.3283±0.13890.2786±0.0604 CpG8.90.1550±0.01520.1800±0.01550.1783±0.03060.1700±0.0277 CpG100.3333±0.01750.3617±0.04880.3333±0.03010.3471±0.0345 CpG110.3250±0.03730.3217±0.07030.3033±0.03670.3214±0.0460 CpG12.130.3633±0.05570.3533±0.03450.3367±0.03080.3800±0.0332 CpG140.4717±0.05040.4683±0.03970.4417±0.03430.4643±0.0270 CpG150.4717±0.05040.4683±0.03970.4417±0.03430.4643±0.0270 CpG160.3100±0.03350.3140±0.
06470.3000±0.06840.3129±0.0594 CpG170.1267±0.04760.3120±0.39970.1550±0.03990.1500±0.0420 CpG180.2983±0.03310.2800±0.03410.2850±0.02670.3157±0.0294 CpG190.2017±0.01600.2317±0.0331*0.1933±0.0151AA0.2029±0.0222 CpG20.210.2217±0.03660.2183±0.03060.2167±0.02160.2214±0.0157 CpG22.230.4600±0.01790.4933±0.0383*0.4767±0.02250.4843±0.0237 CpG24.250.4500±0.06290.4467±0.03670.4433±0.02730.4643±0.0294 CpG260.4200±0.02450.4483±0.05000.4350±0.02350.4457±0.0299 CpG270.5717±0.02140.5783±0.04490.5750±0.01050.5657±0.0276注：与正常组比较:*P<0.05；与模型组比较:△P<0.05,AA P<0.01。
续筋、强身健骨)o结果表明，模型组与正常组相比，第1-6腰椎骨密度显著降低；股骨头骨皮质骨板变薄，骨松质骨小梁明显变细，有些部位破坏、断裂，骨髓腔明显扩大，说明PMOP模型复制成功。补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模型组相比，第1-6腰椎骨密度均显著升高；股骨头显微形态结构病理改变均明显改善，说明本研究补肾健骨中药复方可有效防治PM0Po模型组与正常组相比，骨组织Leptin启动子-493bp----19bp CpG19、CpG22.23甲基化水平显著升高，说明去卵巢造成骨组织Leptin启动子高甲基化，从而抑制其转录，下调其表达，进而下调核心结合因子a1、碱性磷酸酶、骨
钙素、骨桥蛋白、I型胶原表达，抑制成骨细胞分化和骨形成，导致骨质疏松。补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模型组相比，骨组织Leptin启动子-493bp—19bp CpG19甲基化水平显著降低，说明补肾健骨中药复方和仙灵骨葆均可降低去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Leptin启动子甲基化，从而促进其转录，上调其表达，进而上调核心结合因子a1、碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、I型胶原表达，促进成骨细胞分化和骨形成，有效防治PM0Po
20世纪重大发明
本研究表明，骨组织Leptin启动子甲基化水平升高是PMOP发病的分子机制之一；补肾健骨中药复方功能补肾填精、生髓健骨，通过降低骨组织Leptin启动子甲基化水平的分子机制，有效防治PM0Po本研究为中医“肾主骨”理论提供了科学的实验依据，并为PMOP的防治提供了新的有效靶点。
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