甲基化特异性PCR
1 MSP的基本原理 (1)
2利用MSP分析特定基因的甲基化状态的步骤。 (2) 3 基因启动子CpG岛甲基化分析 (3)
3.2染体DNA样本制备 (4)
3.2.1 材料 (4)
3.2.2步骤 (5)
3.3 DNA样本的Bisulfite处理 (7)
3.3.1材料 (7)
细菌试验3.3.2步骤 (7)
3.4 甲基化PCR (8)
国电物资商务网在高等真核生物中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸中的C上，是由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)催化的、将S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-methionine,SAM）上的甲基转移至胞嘧啶含氮杂环5’位上的修饰反应。
DNA中富含CpG甲基化位点的区域称之为CpG岛(CpG island)，大多数基因的启动子，包括第一外显子内都有CpG岛存在。CpG岛的高度甲基化与基因转录失活密切相关，特别是位于抑癌基因启动子区的CpG岛高度甲基化。将导致这些基因功能的封闭，从而促进肿瘤的发生与发展。因而，对CpG岛甲基化状态的分析，对理解正常和病理条件下的基因表达及其与疾病发生和发展之间的关系具有重要作用。
甲基化特异性PCR (methylation-specifific PCR,MSP) 是近年来被广泛采用的、高效、灵敏和特异性的甲基化分析法。该法不受CpG所处位置的限制，能对任何位点上的CpG的甲基化状态进行分析。
1 MSP的基本原理
MSP的基本原理是当用化学试剂Bisulfite(亚硫酸氢盐)处理样本时，所有未
被甲基化的胞嘧啶(包括CpG外的C)将发生氧化性脱氨基作用，使胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，而CpG中5’甲基化的C则不能发生这种脱氨基反应。
甲基化和非甲基化的CpG岛经Bisulfite处理后，其碱基序列将不再相同。据此可分别设计甲基化引物和非甲基化两对引物，去扩增Bisulfite处理的DNA 模板，以是否能获得相应的PCR产物来确定作为模板的CpG岛的甲基化状况。如果仅能用甲基化引物得到预期的PCR产物，表明该CpG岛高度甲基化，与之相反，仅能用非甲基化引物获得PCR产物时，该CpG岛为非甲基化。若两对引物都得到阳性PCR产物，表明DNA样本为部分甲基化。需要注意的是，Bisulfite 处理后，DNA的两条链将不再互补，P引物必须依据其中的一条链(通常用有意义链)的碱基序列来进行设计。
MSP的另一个优点是，Bisulfite处理反应不完全对结果判断不造成影响。MSP引物是以非甲基化的G
全部氧化性脱氨为U作为前提来设计的，无论是甲基化引物还是非甲基化引物，都不能结合到Bisulfite反应不完全的DNA模板上。2利用MSP分析特定基因的甲基化状态的步骤。
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利用MSP分析特定基因的甲基化状态一般有如下几个步骤。
①确定待分析基因启动子内的CpG岛。
一般可从发表的文献和GenBank数据库中获得相关信息。对于新基因则需通过实验研究对启动子进行克隆和鉴定。
②从待分析的CpG岛的DNA序列中，出全部CpG位点（潜在的甲基化位
点)。推断经Bisulfite处理后，甲基化和非甲基化的CpG岛的DNA序列。
因在随后的PCR反应中，模板中的U将被T所替代，故在推断的系列中，所有的U均写为T。以精胺氧化酶基因启动子的CpG岛为例。
野生型CpG岛DNA序列：CGGGCTCCCCGCCCCCGGTGGGCG…CGGCGCCTACGGTCCCGGCGGCGG多少次我回回头看看走过的路
非甲基化CpG岛经Bisulfite处理后的DNA序列
TGGGTTTTTTGTTTTTGGTGGGTG…TGGTGTTTATGGTTTTGGTGGTGG
甲基化CpG岛经Bisulfite处理后的DNA序列CGGGCTTTTCGTTTTCGGTGGGCG…CGGCGTTTACGGTTTCGGCGGCGG
③根据推断的DNA序列，分别设计非甲基化PCR引物和甲基化PCR引物。在
引物设计时应注意如下几点:
a．引物覆盖的序列(野生序列)含较多的C，最大程度避免Bisulfite处理不完全对随后PCR结果的影响;
b．引物的3’末端最后一个碱基为CpG中的C。以增加PCR的特异性;
c．上下游引物之间的距离不要太长，以PCR产物为200bp左右为宜.较短的PCR距离有利于特殊样品，如石蜡包埋的组织和陈旧DNA样品的分析。上述CpG岛经Bisulfite处理后的引物设计如下。
非甲基化引物:
上游：5’-TTTTTTGTTTTTTGGTGGGTG-3’
下游：5‘CACCAAAACCATAAACACCA-3’
甲基化引物:
上游5’-TTTTTCGTTTTCGGTGGGCG-3’
下游5’-CGCCGAAACCGTAAACGCCG-3’
③组织或细胞中分离纯化染体DNA，经Bisulfite处理后用DNA模板，分别 以非甲基化引物和甲基化引物对其进行PCR扩增。
④PCR产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶或2%琼脂糖凝胶电泳。
3 基因启动子CpG岛甲基化分析
武汉科技大学职业技术学院基因启动子区甲基化异常所致的基因表达抑制是近年来的热点研究领域。特别是启动子区的高甲基化所致的抑癌基因表达抑制，被发现是多种肿瘤发生和发展的重要诱因，因而，对这些抑癌基因甲基化状态的分析，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。
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为方便理解和叙述，以人抑癌基因HIN-1为例，介绍甲基化特异性PCR(MSP)及其相关实验技术。HIN-I(H在正常（High in normal-1）是新近鉴定的一个抑癌基因，位于染体:5q35。根据基因表达系
列分析(SAGE)获得的基因表达谱，HIN1- 1在正常乳腺腺腔上皮细胞中大量转录，而在原位管道癌(ductal carcinoma insitu)中则不表达，HIN-1基因启动子区的高甲基化是其表达沉默的分子基础。
3.1 引物设计
根据Bisulfite处理后H1N-1基因启动子内CpG岛的DNA序列，设计出一对非甲基化引物和一对甲基化引物。两对引物可分别用于扩增经Bisulfite转化的非甲基化序列和甲基化的序列。
非甲基化引物
上游引物：5’-GAAGTTTTGTGGTTTTGTTTGGGTAGTT-3’
下游引物：5’CACACAAAACCCCAAAAAAACAACA-3’
甲基化引物
上游引物:5’-GTTTCGTGGTTTTGTTCGGGTAGTC-3’
下游引物:5’- GCAAAACCCCAAAAAAACGACG-3’
前者的PCR产物为90bp，后者的PCR产物为88bp。如果样品较少或者样品太珍贵，而且又计划同时
做多个基因的甲基化时，可以考虑做巢式PCR。此时应设计两套PCR引物，一对外侧PCR引物和两和对内侧PCR引物(甲基化和非甲基化引物)。用外侧PCR引物扩增时，可以同时加入几个基因的外侧引物以提高效率和节约DNA样品。
巢式PCR外侧引物也是依据经Bisulfite处理后的DNA序列来设计的，但这对引物必须同时满足扩增甲基化样品和非甲基化样品的需要。因为在上游引物覆盖的DNA序列内，CpG中的C经B3iulfite处理后可出现C(甲基化)和T(非甲基化)两种可能的情况，因此，在引物设计时，该位点设计为Y(C+T)。同理，在设计下游引物时，G(甲基化)和A(非甲基化)两种状态，设计引物时将该位点设计为R(G+A)，依照上述原则，H1N-1基因启动子外侧PCR引物序列如下。
外侧上游引物:5’-GAGYGGGTAGGGTTTTTTTAGGAG-3’
外侧下游引物:5’-CTCACCRAAACTACAAAACAAAAC-3’
3.2染体DNA样本制备
3.2.1材料
胰酶消化液(0.25%)胰酶，1mmol/LEDTA,pH8.0),PBS(137m mol/L
NaCl,2.7mmol/L KCl,10m mol/L Na2HPO4，2m mol/KH2PO4,pH7.4),DNA消化缓冲液，（25mmol/L TrisCl.1%SDS,10mmol/L EDTA,pH8.0），蛋白酶K(10mg/mL)，酚/氯仿抽提液(pH 7.8~8.0) ,3mol/L 乙酸钠（pH5.2）,TE10mmol/LTris-HCl,1mmol/L
EDTApH8.0)
3.2.2步骤
1从培养细胞中制备染体DNA当细胞培养瓶中的细胞密度达70%-80%时，即可用于提取DNA。
收集细胞（以50mL的细胞培养瓶为例)。吸弃细胞培养液，以PBS洗涤细胞1次，于培养瓶内加入0.5-1mL胰酶消化液室温消化。因不同的细胞消化所需的时间长短不一，最好在显微镜下观察细胞的形态变化，当细胞质回缩，细胞间隙变大，甚至出现极少数细胞漂浮时，立即加人细胞培养液终止消化，反复轻轻吹打贴壁细胞，然后将细胞悬液转到15mL离心管中，800rpm离心5min，吸弃上清，用PBS溶液清洗细胞1次。弃上清液。
②蛋白酶K消化。将细胞重悬于1mL溶液并转入 1.5mLEP管中，管中，于
2000r/min离心5min，弃上清液后，用手指轻弹管底使细胞悬浮于少量残留的PBS溶液中，加400~800μL DNA消化缓冲液和蛋白酶K(10mg/mL)使终浓度为500μg/mL，混合，置于50~55℃水浴消
化消化(间歇颠倒混合以避免细胞下沉，影响消化效果)。完全消化(管内液体豁稠度降低，吸取液体时没有拉丝现象)一般需要3~6h，也可消化过夜。
③平衡酚/氯仿(1，功抽提消化祥品。消化样品放置片刻使温度降至室温，加人
等体积的酚/氯仿抽提液，充分混合，13000r/min离心10min，转移上层水相至一新的1. 5mLEP'管中。如果需要可以重复酚/氯仿抽提1-2--次，以提高DNA样品的纯度。
⑤醇沉淀。加人1/10体积3mo1/L乙酸钠(pH5.2)或者7.5mol/L乙酸铵，2倍体
积的无水乙醇，颠倒混合，于4℃下13000r/min离心10min，弃上清，此时可见管底的白DNA沉淀。加70%乙醇1mL洗涤沉淀，13000r/min离心5min弃上清。小离心机上离心55，小心吸弃残留上清，室温下空气千燥10min。
⑤加人ddH2O(双蒸水)或者TE液(pH8.0)溶解DNA，置4℃过夜。测定样品浓度
后-20℃冻存。
注意事项
酚/氯仿抽提时，吸取上层水相要小心，既不要取到两相之间的白沉淀，也不要取到下层的液体，否则会影响DNA的纯度。蛋白酶K消化时，在水浴中
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