从遗传学中⼼法则看，基因表达沉默⽆⾮从两个⽔平研究，先将具体⽅法总结如下 1基因组DNA⽔平
1.1 构建基因重组打靶载体
基因功能研究中出现最早最成熟的技术就是基因敲除. 他是根据同源重组的原理, 利⽤分⼦⽣物学技术增强和减弱甚⾄灭活某特定靶基因表达⽔平, 然后观察实验动物整体功能状态的变化, 推测靶基因的功能[1]. 基因敲除技术可在整体动物⽔平研究基因功能, 但是完全基因敲除使⼩⿏所有细胞基因组上都存在基因的缺失或突变, 有些重要的靶基因敲除或导⼊会严重影响动物胚胎的发育, 导致胚胎早期死亡或严重的发育缺陷, 使得突变⽆法传代, 不利于在⼩⿏ 各个发育阶段进⾏该基因功能的分析. 条件基因敲除技术(conditional gene knock out)的建⽴为此难题到了解决的办法. 1994年, Gu et al [2]应⽤Cre/loxP重组酶系统实现了外源基因的时
间特异性表达, 在此基础上条件基因敲除技术得以形成. 条件基因敲除技术是在基因敲除基础上结合Cre/loxP系统⽽形成的, 他可以做到在特定时间, 组织, 细胞中将靶基因敲除, 从⽽可以真实的反映特定组织或细胞中靶基因被敲除或修饰后的结果, 避免在发育早期所有细胞和组织中完全敲除⽬的基因后可能产
⽣的胚胎早期死亡或严重的发育障碍[3-5]. 基因敲除的优点是基因灭活效果确切可靠, 缺点是技术复杂, 费时费⼒.
1.2 反义寡核苷酸技术
纳米微粒反义寡核苷酸技术是指采⽤⼀类经⼈⼯合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸⽚段, 长度多为15-30个核苷酸, 导⼊细胞或者个
体体内, 根据碱基互补原理, 通过与靶DNA或者mRNA结合形成双链杂交体激活核酸酶H, 裂解靶mRNA阻断蛋⽩质的翻译, 或者与DNA结合
成三链结构或与单链DNA结合成双链结构以阻⽌靶基因的复制或转录, 以及与mRNA AP位点结合⼲扰其剪接、加⼯和运输, 在mRNA⽔平上发挥作⽤, 从⽽⼲扰其表达, 阻⽌其翻译成蛋⽩质[6]. 具体的作⽤机制⽬前尚未完全清楚. 反义寡核苷酸因为是针对特定的靶mRNA(DNA)
的序列设计合成, 因此具有极⾼的特异性, 并且容易设计和体外⼤量合成. 另外反义寡核苷酸不含病毒序列, 不会产⽣免疫反应, 也不会整合⼊宿主染⾊体内, 这都为其作为药物应⽤于临床提供了可能. 1998年, 第1个反义药物Vitravene(Fomivirsen)被美国FDA批准通过, ⽤以由巨细胞病毒(cytomegalovirus)引起的艾滋患者的视⽹膜炎[7]. ⽬前反义寡核苷酸技术在动物体内外的应⽤已经⾮常普遍[8-9]. 今后要注意的是, 如何对反义寡核苷酸进⾏更加有效的
化学修饰以提⾼其稳定性, 延长其半衰期, 增加其作⽤时间和如何定点作⽤于特定部位, 使靶组织最⼤效率地吸收反义核酸, 提⾼其作⽤效果, 减轻毒副作⽤[10].
1.3 甲基化寡核苷酸技术
表观遗传学(epigenetics)是与遗传学(genetics)相对应的概念. 遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达⽔平变化, 包括基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定性等;⽽表观遗传学则是指基于⾮基因序列改变所致基因表达⽔平变化, 包括DNA甲基化、组蛋⽩脱⼄酰化和染⾊质构象变化等; 表观基因组学(epigenomics)则是在基因组⽔平上对表观遗传学改变的研究, 以抑癌基因为代表的CpG岛甲基化所致基因转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重点内容[23-25]. 所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作⽤下, 基因组5'端CpG⼆
核苷酸的胞嘧啶第5位碳原⼦上共价结合⼀个甲基基团. 由于DNA甲基化与⼈类发育和肿瘤疾病的密切关系, 特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活, DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容, 研究DNA甲基化与肿瘤的关系成为当前分⼦⽣物学的热点之⼀. ⽬前的研究已经表明: 肿瘤细胞和组织中存在异常的DNA甲基化状态, 表现为基因组整体甲基化⽔平降低, 导致遗传不稳定性增加；组织特异性基因的启动⼦区域出现从头甲基化从⽽导致基因被关闭; 原癌基因多为低甲基化或不充分甲基化, 低甲基化使原癌基因活化, 导致重新开放或异常表达, 形成突变热点, 增加染
⾊体的不稳定性; 抑癌基因多为过度甲基化, 过度甲基化导致表达失活[26-27]. 这些因素综合起来导致基因表达异常, 引起细胞恶变, 最终导致肿瘤的发⽣[28-30].在哺乳动物中, 甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG). 通常细胞中CpG⼆核苷酸的甲基化分布并不是均⼀的, ⼤约50%的基因在启动⼦区域有CpG⼆核苷酸的富集现
象, ⼀般该区域的长度从0.5-2 kb不等. 该区域与基因的转录有密切的关系, 通常处于⾮甲基化状态. 处于⾮甲基化状态的启动⼦, 环绕的染⾊质呈现为开放的构象, 允许转录因⼦和其他的激活物靠近. 此外, 转录因⼦的占据也使其他的转录抑制因⼦和染⾊质重塑蛋⽩等难以接近启动⼦, 最终表现为启动基因表达[31-33]. 相反, CpG岛⾼甲基化的启动⼦则呈现为关闭的构象, 不但使转录因⼦⽆法靠近, ⽽且还有助于甲基胞嘧啶结合蛋⽩﹑转录辅阻遏蛋⽩﹑DNA甲基转移酶等对转录有抑制作⽤的蛋⽩结合于启动⼦区, 启动⼦失去功能, 结果基因转录灭活⽽沉默[34-35]. 很多资料表明, 基因启动⼦异常⾼甲基化可以导致其转录灭活[36-39]. Zhu et al [40]通过甲基化寡核苷酸诱导ERβ基因启动⼦区和外显⼦区CpG岛特异性甲基化发现, 在前列腺癌细胞中, 是ERβ基因启动⼦区(⽽不是外显⼦区)CpG岛的⾼甲基化导致了ERβ基因转录失活. 去甲基化试剂作⽤前列腺癌细胞后, ERβ mRNA恢复表达.
甲基化寡核苷酸技术是利⽤针对靶基因合成的甲基化寡核苷酸⽚段(methylated oligonucleotides,MON)与基因的其中⼀条链互补结合形成半甲基化DNA. 半甲基化DNA表现为复制叉样结构, 为DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase-1, DNMT1)的优先底物, DNMT1使第
rc振荡电路
1链迅速甲基化. MON与结合点分离, 甲基化的第⼀链与未甲基化的互补链退⽕形成第2个半甲基化DNA底物, 同样表现为复制叉样结构, 为DNMT1作⽤的优先底物. 结果两条链均发⽣甲基化, 随后, 同样的道理, 甲基化扩布到邻近的CpG⼆核苷酸中, 最后整个基因的靶位点(如启动⼦)发⽣完全甲基化[41]. 如上所述, 基因启动⼦甲基化可以导致其转录失活, 因此通过甲基化寡核苷酸技术, 我们就可以对所要研究的⽬的基因进⾏特异的灭活[42-43]. 此外, 尚有资料表明,CpG岛甲基化表型(CIMP)能够改变染⾊体的构象, 产⽣微卫星不稳定性(MSI)现象, 引起靶基因突变失活[44-49]. 这种有趣的现象使遗传学和表观遗传学之间建⽴起了桥梁, 为研究两者之间的联系提供了思路[50]. 基因CpG岛的这种甲基化修饰具有可遗传性, 能够对发育、⽣理、环境、病理等不同的信号作出反映, 使遗传信息的表
达按⼀定程序发⽣变化, 参与完成细胞的时空调控和适应调控, 在胚胎发育障碍等先天性疾病以及恶性肿瘤发病机制中起⾄关重要的作⽤.
甲基化寡核苷酸技术的实施路线包括: (1)MON的设计与合成: MON是包含20余个碱基的⼀⼩段寡核苷酸⽚段, 与⽬的基因启动⼦区对应位置的碱基序列完全相同, 不同的是MON⽚段中的5'端CpG⼆核苷酸中的胞嘧啶环5位碳原⼦发⽣甲基化(m5CpG). ⽽GenBank数据库中原始的⽬的基因启动⼦区的CpG⼆核苷酸并未发⽣甲基化修饰(CpG). MON⽚段设计时应注意⾄少包含3个CpG⼆核苷酸, 理论上MON⽚段中所含的m5CpG越多越好, 这样才能达到更好的甲基化诱导效果. 为了防⽌在细胞中被酶降解, 寡核苷酸⽚段还需进⾏硫代磷酸化等修饰, 此外还可以标记荧光来⽰踪,
同时还需要设计⾮甲基化寡核苷酸⽚段(unmethylatedoligonucleotides, UMON)作为对照. UMON碱基序列与MON完全相同, 不过没有进⾏CpG ⼆核苷酸甲基化修饰. MON的合成与引物合成⼀样, 可由DNA⾃动合成仪来完成, 价格⽐较低廉. MON的作⽤: 针对体外细胞的应⽤, 通常采⽤的是脂质体介导的基因转染, 体内实验的资料⽬前不多. ⽬前把MON导⼊体内外的基因转染⽅法主要有两⼤类: ⼀类为病毒介导法, 即利⽤去掉了致病基因的病毒序列作为载体, 将外源靶基因导⼊靶细胞内, 常⽤的有逆转录病
毒、疱疹和腺病毒等改建的病毒载体; 另⼀类为⾮病毒介导法, 包括物理法(显微注射、⽓溶胶、基因和缝线等)、化学法(磷酸钙沉淀
法、脂质体法和葡聚糖法等)和⽣物学法(细胞融合法和受体法等). (3)效果评价: 提取基因组DNA和总RNA以及蛋⽩质, 采⽤甲基化特异性
PCR(MSP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、RT-PCR、Western blot等⼿段进⾏相关的分析. 其中, MSP法可以了解是否发⽣了特异性的甲基化诱
导,BSP可以对那些发⽣了甲基化的CpG进⾏精确定位[51-53]. RT-PCR、Western blot则可以从不同分⼦⽔平判断基因灭活的效果及其他相关分析.
⽬前甲基化寡核苷酸技术的应⽤多集中在肿瘤细胞系[60-61], 这实际上就是把他作为⼀种基因沉默的⼯具应⽤到过度表达的肿瘤相关基因的研究中, 借此观察这些靶基因的功能. 甲基化寡核苷酸技术在此所起的作⽤可以⽤前述的其他基因沉默⼯具代替. 然⽽, 甲基化寡核苷酸技术尚具有基因敲除等技术所不能代替的优点. 例如, 针对肿瘤细胞中抑癌基因启动⼦发⽣甲基化⽽失活, 我们就可以将正常的组织细胞或动物模型作为研究对象, 采⽤甲基化寡核苷酸技术来诱导其发⽣甲基化⽽失活, 模拟肿瘤细胞和组织中该基因的甲基化⾏为, 从⽽⽣动地再现肿瘤细胞和组织中抑癌基因甲基化灭活
的过程, 达到相关研究的⽬的. 这主要是基于甲基化寡核苷酸技术的作⽤机制和肿瘤细胞中的抑癌基因的基因型. 实际上肿瘤相关基因启动⼦⾼甲基化导致转录沉默, 甚⾄发⽣MSI突变⽅⾯的⽂献数不胜数[44-49]. 因此, 甲基化寡核苷酸技术的应⽤⼤有前景, ⽽这正是其他基因沉默⼯具所不能⽐拟的. ⽬前甲基化寡核苷酸技术应⽤于体内实验的资料不多, 毒副作⽤的研究很少, 和反义寡核苷酸技术以及⼲扰RNA技术等其他基因⼿段存在的问题⼀样. 如何⾼
效、靶向、安全地把这种神奇的甲基化寡核苷酸⽚段应⽤到个体体内是⽬前存在的问题之⼀，这有赖于靶向载体研究的进展.
皮相猎影1.4 锌指核酸酶技术
锌指核糖核酸酶（ZFN）由⼀个 DNA 识别域和⼀个⾮特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由⼀
系列 Cys2-His2锌指蛋⽩（zinc-fingers）串联组成（⼀般 3~4 个），每个锌指蛋⽩识别并结合⼀个特异的三联体碱基。锌指蛋⽩源⾃转录调控因⼦家族（transcription factor family），在真核⽣物中从酵母到⼈类⼴泛存在，形成alpha-beta-beta⼆级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，⾻架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引⼊序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。现已公布的从⾃然界筛选的和⼈⼯突变的具有⾼特异性的锌指蛋⽩可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。多个锌指蛋⽩可以串联起来形成⼀个锌指蛋⽩组识别⼀段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合⽤于设计ZFNs。与锌指蛋⽩组相连的⾮特异性核酸内切酶来⾃FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是来⾃海床黄杆菌的⼀种限制性内切酶，只在⼆聚体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每个FokI单体与⼀个锌指蛋⽩组相连构成⼀个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp），两个单体ZFN相互作⽤产⽣酶切功能。从⽽达到 DNA 定点剪切的⽬的。
2009年7⽉24⽇出版的《科学》杂志上，研究⼈员描述了创建带有永久性、可遗传基因突变⼤⿏的锌指核酸酶技术新应⽤，从⽽为开发出带有⼈类疾病的新型基因⼯程动物模型铺平了道路。锌指核酸酶技术将使此类动物的创建速度更快，也许还可能创造出不同于⼤⿏的其它实验物种。
威斯康⾟医学院的⼈类和分⼦遗传学研究中⼼主任霍华德•雅各布医学博⼠说，到⽬前为⽌，⼤⿏遗传学家缺乏基因敲除或突变的可⾏技术，以了解这些特定基因的功能。此项研究表明，锌指核酸酶技术
吕侃近况可绕过⽬前必需的繁琐实验环节，如核转移（克隆）或胚胎⼲细胞等，并允许快速地建⽴起新的动物模型。
这篇题为《经由胚胎微量注射锌指核酸酶创建基因敲除⼤⿏》的论⽂指出，科学家使⽤锌指核酸酶技术，在不影响对其他基因测量效果的情况下，敲除了⼀个插⼊的外来基因和两个天⽣的⼤⿏基因。重要的是，基因变异⼤⿏的后代也携带了这个变化，这表明这个基因改变是永久的和可遗传的。总之，研究结果展⽰出了将锌指核酸酶转运⼊早期胚胎，能快速建⽴起遗传并敲除整个⽣物体内的变异基因的能⼒。
2 RNA ⽔平
太原刚玉物流工程有限公司老家的树RNA⼲扰(RNA interference, RNAi)为第3代抑制哺乳动物细胞基因表达的有效⽅法. 他主要是指由外源或内源性的双链RNA(doubles t r a n d RNA, d sRNA)导⼊细胞⽽引起的与dsRNA同源的mRNA降解, 进⽽抑制相应的基因表达. dsRNA前体进⼊细胞后, 由核酸酶Ⅲ-Dicer处理为21-23个碱基的⼩⼲扰RNA(smallinterferencing RNA, siRNA). 这些⼩⼲扰RNA分⼦能与解螺旋酶、核酸酶等结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing complex,RISC), 并与靶基因的互补mRNA结合, 将mRNA降解, 在转录后⽔平抑制靶基因的表达, 因⽽⼜称为转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing, PTGS)[11-12]. RNA⼲扰出现的时间不长, 从1998年的初次报道开始[13], 短短⼏年中,R
NAi的研究取得了突飞猛进的发展[14-15], 并被美国科学界评为2002年度最重要的科技成果之⼀. 2006年Andrew Fire和Craig Mello也正是凭借在RNA⼲扰领域所做出的杰出贡献⽽被授予诺贝尔医学奖[16]. ⽬前正在进⾏的基因组siRNA⽂库的建⽴必将为从全基因组⽔平对⾼等动物基因功能进⾏⾼通量RNAi 研究打下坚实的基础[17]. 相对基因敲除, 反义寡核苷酸技术, RNA⼲扰技术在操作上相对简单, 基因沉默灭活效果可靠, 有望开发出新药应⽤于临床[18], 尤其是在肝炎和艾滋病等顽固性病毒性疾病的中有可喜的应⽤前景[19-22]. 缺点是⽆法局限作⽤于特定组织和细胞, 这有赖于载体靶向系统研究的进展.
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