校园居
一,定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基.
二,定点突变的原理
通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了. 三,引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复.
氘气
突变引物设计的特殊原则:
(1)通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物长度为30~35 bp.一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12 bp.若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失
败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物.
(2)如果设定的引物长度为30 bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78℃(GC含量应大于40%).
(3)如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%).
(4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置.
(5)最好使用经过纯化的引物.
Tm值计算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注:L:引物碱基数;% of GC:引物GC含量.
四,引物设计实例
以GCG→ACG为例:
布莱克斯科尔斯
5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3'
(1)首先设计30 bp长的上下游引物,并将A (T)设计在引物的中央位置.
Primer #1: 5'-CCTTCAGTA TGTAGACGACTTACTTATTGC-3'
Primer #2: 5'-GCAA TAAGTAAGTCGTCTACA TACTGAAGG-3'
(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5).通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度.
(3)重新调整引物长度.
Primer #1: 5'-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3'
Primer #2: 5'-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3'
在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带
入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了. 水泥胶砂流动度
五,突变所用聚合酶及Buffer
杨丽娟近况引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变.
除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵.可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶,Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase.
六,如何去掉PCR产物
最简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基
化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)
而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株.
DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败.
七,如何拿到质粒
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果.
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