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分子生物学实验报告 |
班级：生工xx 姓名：xxx 学号：xxxxxxxxx | 卡盘扳手
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质粒DNA的分离提取与琼脂糖凝胶电泳
1 引言
质粒（plasmid）是存在于细菌染体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子，分子量一般在0.2~10kb范围内[1]。质粒由于其特殊的性质，已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。我们将通过本次实验了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用，并掌握质粒DNA分离纯化的原理，学习碱裂解法分离质粒DNA和琼脂糖凝胶电泳分离的方法，同时熟练掌握移液器及离心机的使用。
2材料和方法
2.1 实验原理
2.1.1 质粒DNA分离纯化原理
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等
基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。这种载体是由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个 “A”的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率[2]。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂
乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染体DNA与质体DNA分离。
本实验是以碱裂解法（alkaline lysis）的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原分的大肠杆菌染体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107东丰二中bp的DNA片段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA日凌几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 质粒DNA的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。超螺旋的质粒DNA一般迁移最快、开环（缺口）质粒DNA迁移最慢，线化DNA位于两者之间。本实验采用EB对DNA进行染，紫外线照射下呈绿荧光，可清除看到质粒DNA所在位置[3]。
2.2 实验材料
2.2.1 菌种
所用菌种为配置好的大肠杆菌菌液。
2.2.2 药品及试剂
所用药品及试剂有溶液I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM 葡萄糖；溶液II: 0.2M NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制)；溶液III: 3M醋酸钾溶液(KAc, pH 5.2)；异丙醇(isopropanol)；酚/氯仿（1：1）溶液；RNase A: 1mg/ml；1×TAE 缓冲液：40 mM Tris-乙酸, 1mM EDTA（pH 8.0）；TE缓冲液；DNA marker：DL2000；50×TAE电泳缓冲液；琼脂糖；荧光染料；loading buffer等。
2.2.3 实验仪器用具
用到的仪器及用具有台式型离心机；旋涡混合器；移液；琼脂糖凝胶电泳；紫外线透射仪等。
2.3 实验方法
将菌液分2次集于1.5ml离心管中，4000rpm离心1min，弃去上清液。然后加入100ul预冷的
溶液I，在漩涡振荡器上剧烈震荡，充分悬浮菌体。接着加入200ul溶液II，轻柔颠倒几次，将离心管放于冰上1min。加入150ul预冷的溶液III，轻柔颠倒几次，放冰上3~5min。然后加入等体积酚/氯仿（1：1）溶液450ul，颠倒均匀。15000rpm下离心10min绝路狂飙。离心完毕后，将上清液放入另一干净离心管中，加入与所取上清等体积酚/氯仿（1：1）溶液，颠倒混匀。将所得上清放入另一干净离心管中，加入2倍体积预冷的异丙醇，颠倒均匀，-20℃放置30min。取出后于15000rpm下离心10min。取出后去上清，用200ul70%乙醇吹打悬浮沉淀，再于15000rpm下离心5min，去70%乙醇洗涤液，用洗净残留溶液，将其置于超净工作台内吹干。待吹干后，加入20ulTE溶液溶解DNA。
用胶带将制胶板两头封严，然后配0.9%琼脂糖凝胶30ml：称取0.27g琼脂糖加入1×TAE 缓冲液30ml，用微波炉溶胶。冷却至不烫手加荧光染料2ul混匀，倒胶，立即插上梳子，冷却20min，轻轻拔出梳子，立即将凝胶板放入电泳槽，倒入1×TAE 电泳缓冲液，使电泳液完全没过胶。将5ul质粒DNA与1ulloading buffer混匀点入点样孔，最后点5ulDNA Marker。链接电泳槽，注意正负极，DNA从负极向正极跑，100V跑约25分钟，然后带手套将胶小心从胶板上拿起，放在紫外灯下照射拍照。
3 结果
将电泳后的琼脂糖凝胶放在紫外灯的照射下观察结果，拍照得到DNA的电泳条带如图1所示，其中从右数第2个电泳条带为自己的，第3个电泳条带为DNA Marker。图2为DNA Marker的电泳条带图示。
图2 DNA Marker琼脂糖凝胶电泳结果
图1 琼脂糖凝胶电泳结果
4 讨论
4.1 对实验现象的分析及其结论
从图1右二电泳结果看，可以看到有三条较为清晰的条带。其中跑在最前方的电泳条带代表RNA，后两条是提取出的质粒DNA。之所以会出现多条条带，是因为在整个质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂，因此多数质粒提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA、开环DNA、线形DNA，其中共价闭合环状DNA一般迁移最快，开环质粒DNA迁移最慢，线形DNA位于两者之间。由后两条带的亮度可知，跑在前面的条带更亮，因此此条带可能代表了共价闭合环状DNA，后面一个条带可能为开环DNA或线形DNA。将自己做的电泳条带与DNA Marker相对照，可以大概判断出提取的质粒DNA的碱基对数目约为3kb。
从整体的电泳效果来看，电泳条带均清晰可见，亮度适宜，本次试验做得较为成功。
4.2 对实验分析及其结论
4.2.1 三种溶液的作用
溶液I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，而且加溶液I后必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键。且其中含有的溶酶菌可以水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。
溶液II的作用：提供碱性条件，在NaOH与SDS的共同作用下是大肠杆菌瞬间裂解，并变性核DNA。当细胞悬浮于NaOH和十二烷基酸钠（SDS）溶液中使在高pH的作用下细胞发生裂解，此外蛋白质和染体DNA发生变性与细胞碎片一起沉淀下来。这是由于细胞膜发生了从双层膜结构想微囊结构的相变化。新配制的溶液II避免作为最佳溶解细胞的试剂NaOH接触空气中的CO2过久而减弱了碱性。用不新鲜的0.4M NaOH，即便有SDS也无法有效溶
解大肠杆菌。因此必须使用新鲜的0.4M NaOH试剂进行配制。公众安全感
溶液III的作用：该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分离开来；另外溶液III所含有的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA。
4.2.2 酚氯仿抽提DNA体系后出现的现象及其成因
水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚\氯仿始终在下层，方便水相的回收。
酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应。而且含质粒DNA的水相会部分进入到酚中，造成损失。
添加异戊醇，主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，方便了水相的回收。
4.2.3要将DNA庄逢甘保存于TE缓冲液中的原因
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。
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