WesternBlotting免疫印迹（试剂配制--每步操作详解--WB 常见问题分析--分离范围） Western（试剂配制和操作步骤）
试剂配制：（⼀）母液（⼆）使⽤液
操作步骤：（⼀）蛋⽩样品制备（⼆）蛋⽩含量的测定（三） SDS－PAGE电泳
（四）转膜（五）免疫反应（六）化学发光，显影，定影（七）凝胶图象分析
关键词：印迹试剂Western 印迹法免疫反应蛋⽩样品制备SDS－PAGE电泳
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到⼀种固相⽀持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使⽤的探针是抗体，它与附着于固相⽀持体的靶蛋⽩所呈现的抗原表位发⽣特异性反应。这种技术的作⽤是对⾮放射性标记蛋⽩组成的复杂混合物中的某些特异蛋⽩进⾏鉴别和鉴定。
耗材：硝酸纤维素膜，乳胶⼿套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光⽚夹，X-光⽚，玻棒长短各⼀根，计时器，吸⽔纸，试剂配制：
（⼀）母液
1.0mol/L Tris?HCl
Tris(MW121.14) 30.29g
蒸馏⽔200ml
溶解后，⽤浓盐酸调pH⾄所需点（见下所⽰），最后⽤蒸馏⽔定容⾄250ml，⾼温灭菌后室温下保存。 PH HCl
7.4 约17ml
7.5 约16m
7.6 约15ml
8.0 约10ml
10％SDS
SDS10g
蒸馏⽔⾄100ml
50℃⽔浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，⽔浴溶化后，仍可使⽤。10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺0.1g
超纯⽔ 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris?HCl（pH8.8）
Tris(MW121.14) 45.43g
超纯⽔200ml
溶解后，⽤浓盐酸调pH⾄8.8，最后⽤超纯⽔定容⾄250ml，⾼温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8）
Tris(MW121.14) 15.14g
超纯⽔ 200ml
溶解后，⽤浓盐酸调pH⾄6.8，最后⽤超纯⽔定容⾄250ml，⾼温灭菌后室温下保存。20％Tween20
Tween20 20ml
蒸馏⽔⾄100ml
混匀后4℃保存。
（⼆）使⽤液
（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100?g/ml PMSF）：
1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸馏⽔⾄ 50ml
混匀后，4℃保存。使⽤时，加⼊PMSF⾄终浓度为100?g/ml（0.87ml裂解液加⼊1.74 mg/ml PMSF50µl）。
0.01mol/L PBS（pH 7.2-7.4）
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44g (Na2HPO4 .H2O 1.56g \ Na2HPO4 .12H2O 3.58g) KH2PO4 0.2g
蒸馏⽔⾄1000ml江苏交通广播网101.1
G250考马斯亮蓝溶液（测蛋⽩含量专⽤）
考马斯亮蓝G250：100mg
95％⼄醇：50ml
磷酸：100ml
银离子蒸馏⽔⾄1000ml
配制时，先⽤⼄醇溶解考马斯亮蓝染料，再加⼊磷酸和⽔，混匀后，⽤滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44）0.877g
蒸馏⽔⾄100 ml
⾼温灭菌后，室温保存。
100mg/ml ⽜⾎清⽩蛋⽩（BSA）
BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋⽩标准曲线时，⽤0.15 mol/LNaCl进⾏100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。10％分离胶和5％浓缩校 10％分离胶（两块胶，10ml）5％浓缩胶（两块胶，5ml）
10%AP（过硫酸胺）
TEMED
加TEMED后，⽴即混匀即可灌胶。
还原型5X SDS上样缓冲液
（0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L⼆硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％⽢油）0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8） 2.5ml
⼆硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39g
SDS0.5g
溴酚蓝0.025
⽢油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离⼼管中，4℃保存。
电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L⽢氨酸，0.1％SDS）
Tris（MW121.14） 3.03g
⽢氨酸（MW75.07）18.77g
SDS1g
蒸馏⽔⾄1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使⽤3～5 次。
转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L⽢氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）半⼲转1X电转液：⽢氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏⽔⾄1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使⽤3～5次。
湿转1X电转液：
⽢氨酸（MW75.07）11.25g
Tris（MW121.14） 2.375g
SDS 0.375g
甲醇 200ml
蒸馏⽔⾄1000ml
溶解后4℃保存，次溶液可重复使⽤3～5次。
TBS缓冲液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）
1 mol/ L Tris?HCl（pH7.5）10ml
NaCl 8.8g
蒸馏⽔⾄1000ml
TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使⽤，最好现⽤现配。
封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使⽤时，恢复室温，⽤量以盖过膜⾯即可，⼀次性使⽤。
洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris?HCl pH6.8）14.4 mol/L 2-Mercaptoethanol(β-巯基⼄醇) 700 l（通风厨⾥加）
SDS2g
去氧胆酸0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8）12.5ml
超纯⽔⾄100ml
配制时，在通风厨内进⾏。4℃保存。可重复使⽤1次。
10X丽春红染液
丽春红S 2g
三氯⼄酸30g
余华磺基⽔杨酸30g
蒸馏⽔⾄100ml
使⽤时将其稀释10倍。
显影液：H2O 365ml
A 125ml
B 5.1ml
C 4.875ml
4℃保存。
定影液
H2O 363.5ml
A 125ml
B 11.5.ml
4℃保存。
抗体⽤TBST稀释⾄⼀定浓度使⽤，每张膜需0.5ml
化学发光试剂
购⾃北京中⼭公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。
操作步骤
蛋⽩样品制备
SDS-PAGE
SHENKON转膜
阿凡达 阿凡提
封闭
⼀抗
⼆抗
洗膜
显⾊或化学发光显影
（⼀）蛋⽩样品制备
（1）贴壁细胞总蛋⽩的提取：（整个操作尽量在冰上进⾏）
收集细胞，加裂解液100ul漩涡混匀，冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹⼀弹以使细胞充分裂解。在4℃下12000rpm离⼼5min，取上清分装于0.5ml离⼼管中并置于－20℃保存。
（⼆）蛋⽩含量的测定
（1）制作标准曲线
1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备⽤。
2、取适量的蛋⽩标准稀释⾄终浓度0.5 mg/ml ；
按照下表将0.5mg/ml BSA和稀释液PBS加到96孔板中，并取样品2ul加⼊96孔板中，加PBS⾄20ul.（样品和标准品均设置复孔）
3、按A:B=50:1配制适量的BCA⼯作液，混匀，室温24h内稳定。
各孔加⼊200ulBCA⼯作液37°30min
测定A562，求平均值，绘制标准曲线。
（三）SDS－PAGE电泳
电泳时间⼀般为2～3h，电压为80V 30min;120V 3h较好，电泳⾄溴酚兰刚跑出即可终⽌电泳，进⾏转膜。
配制10%的过硫酸铵
配制12%分离胶（5ml)
待胶灌⾄距离玻璃板顶端1.5cm的时候停⽌灌胶，加⼊蒸馏⽔
聚合40分钟后，倒掉蒸馏⽔
配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶
插上梳⼦，聚合20分钟
注意：灌胶过程中避免产⽣⽓泡
（四）转膜
转膜详细操作过程：
（1）转⼀张膜需准备6张7.0～8.0cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜。切滤纸和膜时⼀定要戴⼿套，因为⼿上的蛋⽩会污染膜。PVDF膜则在M-OH中浸泡10min以上后转⼊TBS液中平衡。将滤纸浸⼊TBS液中润湿。
（2）在加有转膜液的搪瓷盘⾥放⼊转膜⽤的夹⼦、两块海绵垫、⼀⽀玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3）将夹⼦打开使⿊的⼀⾯保持⽔平。在上⾯垫⼀张海绵垫，⽤玻棒来回擀⼏遍以擀⾛⾥⾯的⽓泡。（⼀⼿擀另⼀⼿要压住垫⼦使其不能随便移动。）在垫⼦上垫三层滤纸（可三张纸先叠在⼀起在垫于垫⼦上），⼀⼿固定滤纸⼀⼿⽤玻棒擀去其中的⽓泡。
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