赵习武1，2，王晨静1，2，杨丹丹1，2，郭迪1，2，陆国权1，2，3*
（1．浙江农林大学风景园林与建筑学院，浙江临安311300；2．浙江
高士功放机农林大学薯类作物研究所，浙江临安311300；3．浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江临安
311300）
摘要植物脱毒的方法有热处理脱毒法、化学疗法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法和超低温脱毒法。超低温脱毒以其操作简便，将成为下一个应用最广泛的脱毒方法；组织培养脱毒法中的花药培养脱毒的脱毒率为100%，是植物脱毒的又一个新的趋势。文中对这些脱毒方法在园艺植物中的研究进展进行了综述。关键词植物脱毒；超低温脱毒；花药培养中图分类号S188文献标识码A 文章编号0517－6611(2013)16－07074－03Ｒesearch Advance in the Techniques and Methods of Horticultural Plant Virus-Free ZHAO Xi-wu et al (Landscape Architecture and Architecture College of Zhejiang Agricultural and Forestry University ，Lin ’an ，Zhejiang
311300)
Abstract There are several virus-free methods ，such as thermotherapy ，chemotherapy ，tissue culture ，micrografing in vitro and cryotherapy．
Cryotherapy ，as its simple operation ，will be the next most popular method．Anther culture ，whose virus-free rate is 100%，is a new trend．The research progress of these virus-free methods in horticulture plants was discussed．
Key words Virus-free ;Crytherapy ;Anther culture
基金项目
现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CAＲS-11-B-18)。
作者简介赵习武(1987－)，男，湖南邵东人，在读硕士研究生，研究方
向：园林植物与观赏园艺，
E-mail :zhaoxiwu0824@126．com 。*通讯作者，教授，博士，从事地下根茎植物资源开发利用
等研究工作，
E-mail :lugq10@zju．edu．cn 。收稿日期2013-05-05不同作物在世界各地的许多流行病都是病毒引起的，导致了巨大的经济损失， 因此脱毒显得越来越重要。除灵敏的病毒检测、鉴定方法和技术的发展，消除这些病毒的生物技术方法也得到了大量的关注。植物脱毒的方法有热处理脱毒法、
化学疗法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法和超低温脱毒法。文中概括了植物脱毒的技术方法，为今后的植物脱毒提供借鉴。1
热处理脱毒和化学疗法
Kassanis 在1949用热处理方法从植物组织中脱除病毒是热处理脱毒的最早运用
［1］李旭爽
。之后热处理脱毒相继被用来
脱除各种植物病毒。热处理脱毒是将寄主植物放在高温下生长，以阻断病毒的ssＲNA 和dsＲNA 的合成从而明显减少植物病毒的复制。温热钝化点因病毒种类不同而不同，番茄斑萎病毒（TSWV ）的温热钝化点在40 46ħ间变化；烟草花叶病毒（TMV ）的温热钝化点却是90ħ。由于高温能阻止病毒的复制和扩散，
扩大处理茎尖的无毒区，因此热处理脱毒和茎尖培养的结合可在很大程度上提高脱毒率。此方法被用来培育无毒的康乃馨、水仙和菊花及其他的植物。Ｒam 等
［2］
离体培养出了脱菊花B 病毒的菊花品种。他们通过茎
尖培养、化学疗法和热处理脱毒表明：单独通过茎尖培养不能获得脱毒植株，且茎尖培养和热处理脱毒的脱毒率不稳定；最大的菊花B 病毒脱毒率是在2-硫脲嘧啶的作用下经热处理脱毒30d 后获得的。这些结果与早期其他研究团队的结果明显不同。其中一个原因可能是早期的脱毒检测主要依赖生物学检测，而生物学检测的方法并不十分可靠，因为
很多材料用生物学检测显示呈阴性而用ＲT-PCＲ测的结果却是阳性。另一个原因可能是在培养基中添加了防止病毒扩散作用的化学药剂。在外植体和茎尖培养的培养基中加入抗病毒复合物可从感染病毒的外植体或者提供茎尖的植物获得比不添加化学药剂的组织培养法更高的脱毒率，如病毒唑、阿昔洛韦、叠氮胸苷和2-硫脲嘧啶。2
either的用法组织培养脱毒
组织培养脱毒有茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心培养脱毒和花药培养脱毒等类型。2．1
茎尖脱毒
目前最重要的扩繁技术是分生组织增殖，可不经历愈伤组织阶段将顶芽或带一个叶芽的带节茎段培养产生多个芽
［3］
。分生组织再生是脱毒的有效工具。由于
病毒没有自己的新陈代谢和病毒复制途径，因此病毒的复制是依赖寄主细胞的蛋白质和核酸合成机理和机制的路径进行的。因为病毒复制抑制剂对寄主细胞有毒，所以病毒控制是很困难的。大部分病毒不攻击芽的分生组织，因为分生组织细胞的增殖要比病毒的复制速度快，
这就使茎尖培养脱毒成为可能。不过近来也有很多研究表明基因沉默是主要的原因
［4］
。分生组织培养在离体培养中的程序一般都是相同
的。然而，
要想能够分离出芽尖分生组织，而不是含病毒的细胞，最初的外植体就要取得尽可能小。Morel 等第1次阐明用分生组织可从大丽花中消除病毒。至今使用分生组织培养获得无毒的观赏植物已广泛的被研究团队使用。在组织培养中，分生组织培养比愈伤组织培养更合适，因为在继代中持续增殖相同的愈伤组织会提升基因或表观遗传变异的概率。目前大丽花、
小苍兰、天竺葵、百合花等已用分生组织培养获得了无毒植株。然而，用分生组织获得脱毒植物的生产存在很多障碍，如分生组织的大小、分生组织在植株上的位置以及在检测过程中，内生感染和恢复阶段及使生产植物生长所运用的方法。而且，病毒在芽尖的分布会因病毒和
责任编辑朱琼琼责任校对卢瑶
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri．Sci．2013，41（16）：7074－7076
植物的结合不同而不同。因此，需切取不同大小的芽尖来测试从而选出最佳的尺寸范围来得到有效的脱毒率和较高的植株再生率。
植株再生能力与芽尖大小成正比，芽尖越小病原体的消除效果越好。而获得脱毒植株的数量与分生组织的大小成反比，被病毒感染的风险也随外植体大小的增大而增加。除这些指示因素外，病毒的消除还依赖病毒在植物组织中的浓度和母株的生理状况。
Hosokawa等［5］发现了一种新的生产无毒植株的方法。他们从菊花、矮牵牛、卷心菜或者康乃馨的茎尖上分离顶端分生组织，发现根端是适合分生组织培养的组织，因为根分生组织细胞分化的潜能很大。
培养基的标准化对于无毒植株再生是最重要的。在离体培养中，形态发生的过程大部分与培养基的成分有关，这也解释了存在较多不同因素影响了离体植株再生率。在一个新几内亚凤仙的试验中，在添加了0．1μmol/L CPPU的培养基上芽的形成率最高。Subotié等也发现了相似的结果。他们统计了苏丹凤仙在离体培养下腋芽的再生情况，结果表明，在添加了0．1μmol/L CPPU的培养基上每个苏丹凤仙外植体产生的腋芽和根数量是最多的；同时凤仙花对TDZ的反应伴随着茎的畸形，即茎变大变平。另一方面，CPPU和TDZ 对新几内亚凤仙和苏丹凤仙芽玻璃化的影响意义重大。2种高浓度的细胞分裂素均可导致变性芽的形成，这些芽并不符合商业生产的标准。不同的组织对含有不同类型腺嘌呤和尿素的细胞分裂素的敏感性不同。细胞分裂素的活动也会因它们在分生组织区域移动的速率和新陈代谢的不同而不同。在这个过程中，细胞分裂素可能被机体内部复合物分解和结合，如糖和氨基酸。康乃馨芽在高浓度的BAP下会出现玻璃化，当BAP浓度高于1mg/L时会增加玻璃化芽的数量。离体生长和形态发生均受培养基中激素和内源激素相互作用和平衡的调节。以上结果清楚的表明培养基的选择是正常表现型植物再生的一个重要步骤。越来越多的证据表明，一些主要的内源植物生长素和细胞分裂素涉及到了可见病症的形成。细胞分裂素影响了细胞分裂、生长、叶绿体的形成和营养物质的转移，
同时影响了病毒感染的过程和病症的发展。Walkey等研究表明在培养基中添加植物生长调节剂可使植物抵抗病毒的感染，因为高浓度的细胞分裂素刺激了母本去阻扰病毒蛋白质的合成。Cybularz－Urban等研究了用分生组织培养从一种杂交兰中消除兰花花叶病毒Cymbidium mosaic virus（CyMV）和齿舌兰环斑病毒Odonto-glossum ringspot virus（OＲSV）的效果［6］，发现带2个叶原基的分生组织可在添加了0．5mg/L ZT和3．2mg/L KT或0．4 mg/L KT的培养基上诱导再生，而在增殖过程中需加入0．2 mg/L ZT或0．5mg/L BAP或0．4mg/L KT；在添加了0．5 mg/L ZT和3．2mg/L KT的培养基上都获得了脱除兰花花叶病毒的植株，而未获得脱除齿舌兰环斑病毒的植株。其他研究者也报道过同样地结论：在培养基中添加植物生长调节剂可降低病毒的浓度。2．2愈伤组织培养脱毒愈伤组织培养脱毒是利用病毒在植物体内不同器官和组织分布不均匀来对植株进行脱毒的一种方法，一般认为病毒在愈伤组织内很难运转，这样未感染病毒的细胞通过增殖即可得到无毒组织，进而得到无毒的植株。将由感病外植体得到的愈伤组织分解为直径很小的颗粒，利用筛分技术筛选后放至培养基上培养，获得了脱辣椒轻斑驳病毒的烟草本塞姆氏（Nicotiana Benthamiana）［7］。香石竹在含苞待放时，花瓣基部是分生能力最强的部分，这部分组织或细胞形成的愈伤组织不带毒的机会很高，利用此原理可获得香石竹的脱毒植株［8］。在愈伤组织培养时还可能产生抗性变异，变异的植株对病毒有抗性，这样也能得到无毒植株。但变异不受人为因素控制，因此很难通过变异得到预期的抗病植株。愈伤组织脱毒工作量大，效果并不稳定，还有可能发生变异。
2．3珠心培养脱毒病毒是通过维管束组织传播的，而珠心组织和维管束系统无直接联系，故可通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。珠心培养在柑橘上已获得成功［9］。珠心培养受限可能是由于珠心材料不能随时获得。
2．4花药培养脱毒花药培养脱毒率可达100%，且可省去病毒鉴定的程序，因此被认为是获得无病毒植株的最佳途径。花药培养脱毒已在草莓上获得成功。花药培养脱毒的程序与一般的组织培养程序大致相同：摘取外植体花蕾，消毒后剥离出花药接种在培养基上进行愈伤组织的诱导，最后得到植株。影响花药培养的因素主要有培养基成分、添加的植物生长调节剂及生理和环境因子。有研究表明麦芽糖比蔗糖的效果更好［10］；Svensson等［11］得出结论，适当的KT和NAA配比对愈伤组织的诱导是必不可少的；Sato等［12］研究发现低温（4ħ）预处理可促进芜菁花药培养时产生更多的愈伤组织。愈伤组织的诱导还受很多其他因素的影响，如基因型和培养条件。花药培养最重要的是花药内激素水平，而小孢子发育过程中，花药内激素水平在不断改变，因此，花粉的发育时期是花药培养成功与否的重要因素。处于不同阶段的花药，其花培效率差别很大，只有花粉发育到一定时期，才对外界刺激最敏感。而不同植物的花粉对外界刺激的敏感时期是不同的［13］。花药培养脱毒虽然在脱毒率上有绝对优势，但花药培养效率较低。
3微体嫁接离体培养脱毒
微体嫁接离体培养脱毒，也称为试管嫁接，是将小于0．2 mm的茎尖作为接穗嫁接至实生苗砧木（无菌种子培养获无菌苗，种子实生苗不带毒）上，连同砧木一起在培养基上培养。成功例子：柑橘、苹果。微体嫁接要求的剥离技术很高，嫁接成活率与接穗大小成正相关；接穗的取材季节也会对嫁接产生影响。
4低温疗法
最近，将外植体长期暴露在低温下然后进行芽尖培养的方法在脱毒方面很成功。芽尖低温疗法的脱毒率很高。当使用低温疗法时，选择只允许有限数量外植体存活（那些最不同的细胞）的条件，从而消除一大批感染病毒的组织。因
5707
41卷16期赵习武等园艺植物脱毒技术方法研究进展
此，低温疗法可获得数量比传统茎尖培养高得多的脱毒再生苗［14］。低温疗法已成功从大量的植物品种中消除病原体（病毒和细菌）：马铃薯、甘薯、葡萄、柑橘、覆盆子、香蕉［15］。在马铃薯中消除番茄斑萎病毒的程序目前已被发展运用到凤仙花中；一个成功的程序被运用到了苏丹凤仙花的免疫定位中［16］。对经DAS－ELISA检测呈阴性的天竺葵属植物进行低温疗法处理，再对天竺葵属芽
尖进行免疫定位，结果表明它们仍然是感染病毒的，用免疫定位可在天竺葵芽尖上，甚至是在分生组织顶端检测到天竺葵碎花病（PFBV）和天竺葵线纹病毒（PLPV）［17］。然而，病毒颗粒大部分都在基础细胞而不是分生组织细胞中。这些结果表明天竺葵碎花病和天竺葵线纹病毒出现在分生组织细胞，低温疗法可部分的减少天竺葵植物上的病毒但不能完全消除。
5结论
茎尖脱毒是目前最成熟的一种脱毒方法，能在短时间内获得大量的脱毒苗，但该方法对操作人员的技术要求较高。还有一些病毒无法用茎尖脱毒脱除。花药培养脱毒的脱毒率为100%，是今后脱毒的一个新方向；超低温脱毒是一种比茎尖脱毒更理想的脱毒方法，操作简便，更适合批量化、产业化生产。目前综合脱毒已成为一种趋势，热处理与茎尖脱毒结合得到了较好的效果。超低温还可与热处理相结合，有些病毒可侵染到茎尖分生组织，这样超低温脱毒的效果就不是很理想，而结合热处理即可扩大茎尖无毒区，从而获得更理想的脱毒效果。今后还可将超低温脱毒与愈伤组织培养脱毒结合，将超低温与花药以及珠心培养脱毒相结合，利用超低温保存可解决珠心培养和花药培养的取材时间限制问题。参考文献
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
111－122．
臣
(上接第7066页)
2．3配合物的抑菌活性根据《消毒技术规范》，对抑菌作用进行判断［17］。抑菌圈直径大于20mm，表示具有强抑菌效果；抑菌圈在10 20mm为中等抑菌；抑菌圈小于10mm为弱抑菌［10］。以溶剂DMF为空白，配合物对3种受试菌种的抑菌作用、抑菌试验结果见表3。由表3可知，溶剂DMF对受试菌种几乎没有抑制作用，因为牛津杯的外径是7．8mm，而试验所得抑菌圈直径为8．1、8．3和7．9mm。而配合物对3种菌种都具有一定的抑制作用。随着样品浓度的增加，配体α－萘乙酸抑菌圈直径增大，抑菌活性同时增强。随样品浓度的增大，配合物的抑菌圈直径也增大，但是在同等浓度下，抑菌能力弱于α－萘乙酸。这可能是由配合物溶解度造成的。配合物对金黄葡萄球菌的抑菌能力最强，说明该配合物对不同菌种的抑制作用也有一定的选择性。
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