成长与成功
缩略语表
缩略词英文全称中文全称APN aminopeptidase
N 氨肽酶N
bFGF bovine basic fibroblast growth factor 基本的成纤维细胞生长因子 DMSO dimethyl
sulfoxide 二甲基亚砜
FCM flow
cytometry 流式细胞术
FCS fetal大容量存储器
calf
serum 小牛血清
G Glycine 甘氨酸
HRP horseradish
peroxidase 辣根过氧化物酶MAPK mitogen-activated动脉mv
protein
kinases 丝裂酶原蛋白激酶MMP matrix
metalloproteinases 间质金属蛋白酶MTT monotetrazolium 单四唑
N Asparagine 天冬酰胺
OAS 2,5-oligoadenylate
synthetase 2'-5'寡腺苷酸PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS phosphate-buffered
saline 磷酸盐缓冲液
日益严重的危机PKB protein kinase B 蛋白激酶B
PVDF polyvinylidene
difluoride 聚偏氟乙烯
R Arginine 精氨酸
RNAi RNA
interference RNA干涉
rpm rounds per minute 每分钟转数
SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠siRNA small
interfering杨子烈
RNA 小干扰RNA SOCS suppressor of cytokine signaling 细胞信号负调控因子
STAT Signal Transducers and Activators of
Transcription
信号转导与转录活化蛋
白
TBS Tris
Buffered
Saline 三羟甲基氨基甲烷缓冲液
IL interleukin 白细胞介素
IFNAR interferon
receptor 干扰素受体
IRF9 interferon
regulatory factor 9 干扰素调节因子9 ISGF interferon
stimulated-gene
factor IFN刺激基因因子ISRE interferon
中山大学bbsstimulated response element 干扰素激活的反应原件
硕士研究生：黄启超
导 师：颜 真 教授
第四军医大学药学系药物基因组学教研室，西安 710032
中文摘要
干扰素-α2a（IFN-α2a）是一种具有抗病毒、抗细胞增殖和调节免疫应答作用的细胞因子，已用于病毒性疾病和肿瘤等的。然而，临床应用发现，体内有多种肿瘤对IFN-α2a并不敏感，所需剂量大，可导致明显毒副作用，限制其在临床的广泛应用。前期研究中，为了进一步提高IFN-α2a的抗肿瘤活性，增加其抗实体瘤的可能性，同时降低毒副作用，减少用药量，我校生物技术中心应用
生物工程技术将能与肿瘤新生血管内皮细胞CD13（又称氨肽酶N, aminopeptidase N, APN）特异结合的多肽NGR肽融合在IFN-α2a的羧基端，在大肠杆菌中表达了融合蛋白IFN-α2a-NGR。体内动物实验显示荷瘤小鼠尾静脉注射IFN-α2a-NGR后，药物在肿瘤组织的血管及周围组织明显富集，由此造成抑瘤作用亦明显强于IFN-α2a，达到相同疗效时融合蛋白的用药量约为普通干扰素的1/3；急性和长期毒性实验均表明融合蛋白不引发明显的毒副作用，安全性与普通干扰素一致。 但在前期研究中我们仍然发现并非所有肿瘤细胞均对IFN-α2a-NGR 敏感，并发现细胞表面干扰素受体（interferon receptor ，IFNAR）表达水平的高低与该细胞对干扰素应答的敏感性相关。为了进一步探索导向干扰素IFN-α2a-NGR抗肿瘤的作用及分子机制，阐明影响肿瘤细胞对IFN-α2a-NGR应答的关键信号分子，寻求逆转肿瘤细胞株对 IFN-α2a-NGR的敏感性的方法，我们在前期实验的基础上，以干扰素受体高表达的人肺腺癌A549细胞和IFNAR低表达的人胃癌MKN-45细胞为模型，在细胞水平分析了导向性干扰素IFN-α2a-NGR的抗肿瘤效应，为其进一步的研发奠定基础。
在本课题中我们通过培养细胞株A549和MKN-45，应用MTT检测、流式细胞术（FCM）、Western blot以及合成siRNA靶向干涉通路中的信号分子，证实了导向干扰素IFN-α2a-NGR与普通干扰素IFN-α2a在细胞和分子水平的效应基本一致，即主要通过JAK/STAT信号途径的激活发挥抑制细胞增殖的功
能。但在干扰素IFN-α2a-NGR刺激后，细胞株A549和MKN-45胞内分子表达变化存在明显差异， A549细胞中，p-STAT1、p53、OAS与SOCS1表达上调； MKN-45中p53、OAS无显著变化， SOCS1显著上调。通过靶向干涉SOCS1，可提高MKN-45细胞对IFN-α2a-NGR的敏感性。
本研究部分揭示了IFN-α2a-NGR抑制肿瘤细胞增殖的分子机制，并初步证实p-STAT1、p53与SOCS1的表达与活化可影响细胞对IFN-α2a-NGR的敏感性，为建立IFN-α2a-NGR敏感肿瘤的快速评价方法，探索提高肿瘤细胞对IFN-α2a-NGR敏感性的途径和方法，以及IFN-α2a-NGR的进一步研发奠定了基础。
关键词：干扰素；IFN-α2a-NGR；肿瘤；信号转导
Experimental study about the antitumor effects of
tumor-targeted IFN-α2a-NGR on cellular level
Candidate for master: Huang Qichao
Supervisor: Prof. Yan Zhen
Department of Pharmacogenomics, School of Pharmacy, the Fourth Military
Medical University
Xi’an 710032, China
Abstract
Interferon-α (IFN-α) are pleiotropic cytokines, extensively used in the treatment of patients with some types of cancer and viral infectious diseases. However， some kinds of cancer are not sensitive to IFN-α and significant toxicity of IFN-α therapy led by high doses were recorded, which have impacted their clinical application. NGR is an oligopeptide which has the ability of tumor angiogenesis specific binding through the surface expression of aminopeptidase N (CD13) in tumor angiogenesis. To increase the anti-tumor activity of IFN-α2a, promote its application in solid tumor and lower its side-effects, the fusion protein IFN-α2a-NGR has been constructed, which was confirmed to possess significant antiangiogenesis activity in vivo and in vitro. After nude mice bearing tumors were treated with IFN-α2a-NGR, the previous results showed that, IFN-α2a-NGR can bind tumor vessels whereas IFN-α2a can not. IFN-α2a-NGR has a more significant inhibition effect on invasion, migration and tube formation of tumors than IFN-α2a. When achieved the similar inhibiting effect of IFN-α2a, the dose of IFN-α2a-NGR would be one-third of the former.
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