第 44 卷第 4 期2021 年 4 月名於，料4元D r u g E v a lu a tio n R e se a rc h Vol. 44 No. 4 April 2021•767 .刺槐素通过调控LZTFL1表达抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭 贾二玲，丁晓，綦航
河北以岭医院急诊科，河北石家庄050091
摘要：目的探讨刺槐素对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法用浓度分别为4、8、16 nrn〇l/L的刺槐素 处理A549细胞，作为低、中、高浓度组，不作任何处理的细胞作为对照组；将p c D N A、p c D N A-L Z T F L l转染至A549细胞 中，记为p c D N A组、p c D N A-L Z T F L l组；将si-NC、si-LZTFLl转染至A549细胞中再用16nmol/L的刺槐素处理，记为刺槐 素+5丨-1^(：组、刺槐素+3丨-1^丁？1^组。四甲基偶氮唑盐比法（\1丁丁）检测细胞增殖抑制率；\¥65160^1(^吨法检测L Z T F L1、CyclinDI、p21、M M P-2、M M P-9蛋白表达；Transwel丨检测细胞迁移和侵袭；实时荧光定量P C R(q R T-P C R)检 测L Z T F L l m R N A表达水平。结果与对照组比较，刺槐素低、中、高浓度处理的肺癌A549细胞中细胞增殖抑制率显著升 高，细胞迁移、侵袭数显著降低，CyclinDl、M M P-2、M M P-9蛋白表达水平显著降低，p21蛋白表达水平显著升高，L Z T F L l m R N A和蛋白表达水平显著升高（P C0.05)。过表达L Z T F L1抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。干扰L Z T F L1表 达逆转了刺槐素对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论刺槐素可能通过上调L Z T F L1的表达抑制肺癌细胞 的增殖、迁移和侵袭。
关键词：刺槐素；L Z T F L1；肺癌；增殖；迁移；侵袭
中图分类号：R965 文献标志码：A文章编号：1674-6376 (2021) 04-0767-07
DOI:10.7501/j.issn. 1674-6376.2021.04.014
Acacetin inhibits lung cancer cell proliferation, migration and invasion by regulating LZTFL1 expression
JIA Erling,DING Xiao,QI Hang
Department of Emergency, Hebei Yiling Hospital, Shijiazhuang 050091, China
Abstract: Objective To investigate the effect of acacetin on the proliferation, migration and invasion of lung cancer cells and i t s molecular mechanism. Methods A549 cells were treated with acacetins at concentrations of 4, 8 and 16 }imol/L, respectively, as the low, medium, and high concentration groups of acacetin, and cells without any treatment were used as control groups; p c D N A, p c D N A-L Z T F L l was transfected into A549 cells and recorded as p c D N A group and p c D N A-L Z T F L l group; si-NC and si-LZTFLl were transfected into A549 cells and treated with 16 jimol/L acacetin and recorded as acacetin+si-NC group, acacetin+si-LZTFLl group. Tetramethylazozolium colorimetry
(M T T) was used to detect cell proliferation inhibition rate; Western blotting was used to detect LZTFL1, CyclinDl, p21, M M P-2, and M M P-9 protein expression; Transwell was used to detect cell migration and invasion; real-time fluorescent quantitative P C R (RT-qPCR) was used to detect the expression of L Z T F L1 m R N A. Results Compared with the control group, the cell proliferation inhibition rate of lung cancer A549 cells treated with low, medium, and high concentrations of acacetin was significantly increased, the number of cell migration and invasion was significantly reduced, and the expressions of CyclinDl, M M P-2 and M M P-9 proteins were significantly reduced, the expression of p21 protein was significantly increased, L Z T F L1m R N A and protein expression levels were significantly increased (P <0.05). L Z T F L1overexpression inhibits the proliferation, migration and invasion of lung cancer c ells. Interfering with L Z T F L1expression reversed the inhibitory effect of acacetin on the proliferation, migration and invasion of lung cancer A549cells. Conclusions Acacetin m a y inhibit the proliferation, migration and invasion of lung cancer cells by up-regulating the expression of LZTFL1.
Key words: acacetin; LZTFL1; lung cancer; proliferation; migration; invasion
收稿日期：2020-06-29
第一作者：贾二玲E-mail: *****************
•768 .第 44 卷第 4 期2021 年 4 月Vo丨.44 No. 4 April 2021
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，中药复方在 肺癌中具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、减少肿瘤转移复发、逆转肿瘤细胞多药耐药、减 轻肺癌症状、调节机体免疫功能等作用[1]。研究肺 癌的发生发展分子机制进而寻新的抗癌药物对肺癌的具有重要意义。研宄发现，黄酮类化合 物具有抗肿瘤作用[2]。刺槐素是一种天然黄酮类单体化合物，可以从多种植物中提取，具有多种生物活性，具有保护心房、镇痛、抗病毒等作用[3]。还有 研究报道，刺槐素有抗癌作用，可抑制卵巢细胞SJCOV3活力，并促进细胞凋亡[4]。刺槐素还可通过抑制P38aMAPK信号通路抑制人非小细胞肺癌A549细胞的侵袭和迁移[5]。然而刺槐素对肺癌细胞增殖的影响及其机制尚不清楚。研宄报道，亮氨 酸拉链转录因子样蛋白1(leucine zipper transcription factor-like1,LZTFL1)位于染体区域3p21.3中，在胃癌组织和胃癌细胞中LZTFL1低表 达，过表达LZTFL1可抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力M。miR-21通过靶向LZTFL1促进乳腺癌的增 殖和转移[7]。LZTFL1可能通过维持上皮细胞分化而抑制肺肿瘤发生[8]。然而LZTFL1对肺癌细胞的増殖、迁移和侵袭的影响尚未可知。本实验旨在研 宄刺槐素对肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及其机制是否与LZTFL1有关。
1材料
1.1细胞
肺癌细胞A549，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。
1.2药物及主要试剂
刺槐素（质量分数>98%，批号20191005)购自 上海远慕生物科技有限公司；胎牛血清（货号YDM1521，美国 Gibco) ;RPMI-1640 培养基（货号 YD6603，厂家：美国Gibco)购自上海羽朵生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT)比法试剂盒（货号JK-a-3459，厂家：美国DGR)购自上海晶抗生物工程有限公司；二辛可宁酸(bicinchoninic acid, BCA)试剂盒（货号MT0072-XOS)、RIPA蛋白裂解液（货号HR0259-AJL)购自北京百奥莱博科技有限公司；Trizo丨试剂（货号AS1050)、反转录试剂盒（货 号A350)、荧光定量试剂盒（货号A6020)购自美国 Progema 公司；Transwell 小室（货号 353090)、Matrige丨胶（货号356234)购于美国B D公司。pcDNA、pcDNA-LZTFL1、si-NC、si-LZTFLl 质粒购自上海伯易生物科技有限公司。CyclinDl(PL0502539)、p21 (PL0502562)、MMP-2 (PL0401099)、MMP-9(PL0502078)、GAPDH(PL0402049)抗体，购 自加拿大PL Laboratories公司；LZTFL1抗 体（FNab04916)购自武汉菲恩生物科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP (AAT-16793)购自美国AAT Bioquest公司。
2方法
2.1细胞处理与分组
肺癌细胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37°C、5%C02条件下培养，隔天换液 1次，细胞消化后以2X10V孔的密度接种在96孔板 中，培养12 h后用浓度分别为4、8、16 pimol/L的刺 槐素处理，作为刺槐素低、中、高浓度组，不作任何 处理的细胞作为对照组。
转染前1d接种细胞，使转染时细胞浓度达到80%左右，用50 n L无血清培养液稀释pcDNA、pcDNA-L Z T F L l载体质粒，轻轻混匀；将 Lipofectamine TM 2 000转染试齐丨J用培养液稀释至50卟；将上述两种液体混匀，室温静置20 min；然后 加入到每孔细胞中，孵育6 h后换培养液继续培养24 h，记为 pcDNA组、pcDNA-LZTFL1组；将 si-NC、si-LZTFLl按上述方法转染至A549细胞后再用16 nmol/L刺槐素处理，记为刺槐素+si-NC组、刺 槐素 +si-LZTFLl组。
2.2 M TT法检测细胞增殖
在各组细胞培养至24 h时，每孔分别加入20 pL MTT溶液，于培养箱中继续孵育4 h后每孔加入DMSO 150 nL，振荡反应10 min使沉淀溶解，用酶 标仪于波长490 nm处检测吸光度C4)值。实验重 复3次。
细胞增殖抑制率=1一实验组•^值/对照组乂值
2.3 Western blotting法检测蛋白表达
在各组细胞培养至24 h时，提取细胞总蛋白，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转至PVDF 膜上，
用5%的牛血清蛋白封闭1h，加入一抗4 °C过 夜；加入二抗室温培养1h，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J软件分析各蛋白条带的灰度水平，以GAPDH作为内标。每个蛋白样品设3个重复，实 验重复3次。
2.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭
调整细胞密度为2X105/mL，取200卟接种于Transwell小室上层，细胞分组及给药同“2.1”项，培 养24 h后，吸去培养液后用PBS洗涤,4%多聚甲醛 固定30 min，再用0.1%结晶紫染10 min，显镜下
C y c linDl
p 21
G A P D H
对照4
16
1.0-
钝化处理
刺槐素/(MJnol-L-〇
|对照
I 刺槐素 4p j n o l _L -1 I刺槐素8p m o l L 1 刺槐素16 n m o l L 1
与对照组比较^p c o .o s
*P < 0.05 vs c o n tro l g ro u p雷视网
图1
增殖相关蛋白表达U ±5，/I = 3)
博士论文Fig. 1 Expression of proliferation-related proteins (%±5,
/i = 3)
MMP -9蛋白表达水平显著降低（P <〇.〇5)，且呈浓
度相关性。见图2和表2。
3.3 刺槐素对肺癌A 549细胞中LZTFL 1表达的影响
与对照组比较，刺槐素低、中、高浓度组A 549 细胞中LZTFL 1 mRNA 和蛋白表达水平均显著升 高(P <0.05)，且成浓度相关性。见图3和表3。3.4 LZTFL 1过表达对肺癌A 549细胞增殖、迁移、 侵袭的影响
与pcD N A 组比较，pcDNA -LZTFLl 组肺癌
A 549细胞中LZTFL 1表达水平显著升高，细胞增殖
抑制率显著升高，细胞迁移、侵袭数显著降低，
CyclinDl 、MMP -2、MMP -9蛋白表达水平显著降低, p 21蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意
义(户<0.05)。见表4和图4。
3.5干扰LZTFL 1表达逆转了刺槐素对肺癌A 549 细胞增殖、迁移、侵袭的作用
与刺槐素+si -NC 组比较，刺槐素+si-LZTFL 1组 肺癌A 549细胞中LZTFL 1表达水平显著降低，细胞 增殖抑制率显著降低，细胞迁移、侵袭数显著升高，
CyclinDl 、MMP -2、MMP -9蛋白表达水平显著升高,
拍照并计数发生迁移的细胞数量。细胞侵袭实验 在Transwell 小室上层加入50 |a L 基质胶Matrigel ，凝固后接种细胞，之后同细胞迁移操作。倒置显微 镜下每孔随机选取5个视野进行拍照和计数，每组 重复3次。
2.5 实时荧光定量PCR (qRT -PCR )检测LZTFL 1
mRNA 表达水平
各组细胞培养24 h 后提取细胞总RNA ，反转录 成cDNA , LZTFL 1以p -actin 为内参进行PCR 扩增， 循环条件为94 °C 、30 s ,55 °C 、30 s ,72 °C 、30 s ，共 40个循环；72 °C 延长5 min 。相对表达量采用2^^ 法计算。LZTFL 1上游引物序列：5'-GGAGCAGCT
GCACATGGCTGAA -3，，下游弓I 物序列：5，- ACATGCCTGAGGTGAGACTGCT -3'; P-actin 上游
引物序列：5’-CCTGTGGCATCCACGAAACT -3'，下 游引物序列：5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT - 3'。 每组样品设 3 个复孔。2.6统计学分析
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，两组比较行；检验，多组间比较采用 单因素方差分析，组间两两比较采用LSD -Z 检验。3
结果
3.1刺槐素对A 549细胞增殖及相关蛋白表达的 影响
与对照组比较，刺槐素低、中、高浓度组A 549 细胞增殖抑制率显著升高(P <〇.〇5)；增殖相关蛋白
CyclinDl 表达水平显著降低，p 21蛋白表达水平显
著升高，且呈浓度相关性（P <〇.〇5)。结果见表1 和图1。
表1
刺槐素对A549细胞增殖的影响（*±s ,w =3>
Table 1 Effects of acacetin on A549 cell proliferation («±5,
n = 3) _____
组别C/(|imol.L—丨）
增殖抑制率/%对照—0.00 士 0.02刺槐素
411.25 土 1.14.829.45士 2.8 T 16
54.65土 5.21.
与对照组比较:_尸<〇.〇5
'P < 0.05 V5 c o n tro l g ro u p
3.2刺槐素对肺癌A 549细胞迁移、侵袭及相关蛋 白表达的影响
与对照组比较，刺槐素低、中、高浓度组A 549 细胞迁移、侵袭数显著降低（户<〇.〇5)，MMP -2、
第 44 卷第 4 期 2021 年 4 月 名於，Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 4 April 2021 * 769
荣智健夫人•
.770 •第 44 卷第 4 期2021 年 4 月名必，•料衬元Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 4 April 2021 M M P-2
M M P-9 G A P D H
m m^
mm mm mm
对照4__________8__________16
剌槐素/〇i m o l L-)
0.8n
*刺槐素4 n m o l L 1
■剌槐素8ji m o l L-1
刺槐素16 n m o l L 1
M M P-2M M P-9迁移
侵袭
对照
刺槐素/〇im o l L1)
与对照组比较^pco.os
*P <0.05 vs control group
图2刺槐素对肺癌A549细胞迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响U±5，/i = 3)
Fig. 2 Effects of acacetin on migration, invasion and expression of related protein of lung cancer A549 cells (x±s,rt = 3)
表2刺槐素对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响(d，/i = 3) 表3刺槐素对肺癌A549细胞中LZTFL1表达的影响Table 2 Effects of acacetin on migration and invasion of s,n = 3)
lung cancer A549 cells (x±stn = 3)
组别C7(fimol.L 丨）迁移细胞数侵袭细胞数对照—115.32 土11.4198.65土9.36刺槐素482.64士8.13.76.14 士7.32.
868.25±6.23*59.36±5.48*
1651.22 士5.13*43.21±4.11*与对照组比较：T<0.05
"P <0.05 vs control group
mm mm
与对照组比较^pco.os
*P <0.05 vs control group
图 3 LZTFL1蛋白表达，/i = 3) Fig. 3 Expression of LZTFL1 protein (x±stn = 3)Table 3 Effect of acacetin on LZTFL1 expression in lung
cancer A549 cells (*±s,« = 3)
组别C7(|imol L丨）L Z T F L1 m R N A
对照— 1.00 土0_08
刺槐素4 1.42 士0.14.
8 1.98±0.18*
16 2.71 士0.26.
与对照组比较:*P<0.05
*P < 0.05 vs control group
表4 LZTFL1过表达对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影
P向（a c士s，w = 3}
Table 4 Effect of LZTFL1 overexpression on lung cancer A549 cell proliferation, migration and invasion (x±s,n =3)
组别
增殖抑制
率/%
迁移细胞数侵袭细胞数p c D N A 6.35 士0.64118.36±10.2199.36±8.74 p c D N A-L Z T F L l41.22 士4.13.59_65 土5.32*51.24 士5.33.
与pc D N A组比较：•PCO.OS
*P < 0.05 vs p c D N A
group
第 44 卷第 4 期 2〇21 年 4 月
名袷，
元 Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 4 April 2021.771 •
■■对照
M l 朿丨】槐索+si-NC
刺槐素+si-LZTFL1
n o D N A
与 pcDNA 组比较：•PCO.OS
'P < 0.05 vs pcDNA group
LZTFL1 CyclinDl p21
MMP-2 MMP-9
pcDNA pcDNA-
LZTFL1
LZTFL1
m
m
CyclinDl m m
p21
MMP-2MM P -9G A P D H m
m
图4 LZTFLl 过表达对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响U ±i,n = 3)
Fig. 4 Effect of LZTFL1 over expression on lung cancer A549 cell proliferation, migration and invasion (x±stn = 3)
p 21蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意
义(P C 0.05)。见图5和表5。4
讨论
侵袭转移是恶性肿瘤发生发展的重要特征之 一，肺癌细胞的迁移和侵袭是其的难点之一[9]。 研究发现中医药在恶性肿瘤领域发挥着越来 越重要的作用[|°]。研究报道，刺槐素可通过(3-连环
蛋白（p -catenin )途径诱导细胞生长停止，并通过激 活凋亡诱导因子诱导大肠癌细胞而凋亡[M]。刺槐 素可诱导头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡[12]。刺槐素 可通过措抗视黄酸受体-丫（retinoic acid receptor -丫，
RARy )对蛋白激酶 B(protein kinase B ，AKT )和 p 53
的非基因组作用诱导肝癌细胞凋亡M 。刺槐素还 增强了阿霉素对非小细胞肺癌细胞的作用[14]。
对照刺槐素刺槐素+刺槐素+
si-NC
si-LZTFLl
对照
刺槐素
刺槐素+si-NC
刺槐素+si-LZTFLl
迁移
樣
与对照组比较：汐<
〇.〇5；与刺槐素+si-NC 组比较
*P < 0.05 vs control group
< 0.05 vs acacetin + si-NC group
图5干扰LZTFL1表达逆转了刺槐素对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用U±5，/i = 3)运动
Fig. 5 Interfering with LZTFL1 expression reversed effect of acacetin on lung cancer A549 cell proliferation and migration
(x±stn = 3)
^
^
主持与播音
^
^.2
i
10.o .
o . o
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