1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤:
实验准备:用75%酒精擦生物安全柜台面2遍,紫外线消毒30分钟(、头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶),复温实验所需试剂[细胞培养液(DMEM、1640)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胰酶(0.25% Trypsin-EDTA)、胎牛血清(FBS)、双抗],所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态,有无污染。 1)倒去培养瓶内的培养液;
2)加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次;
3)加入胰酶500ul/0.5ml 2~10min(具体时间因细胞而异,可在显微镜下看是否贴壁,必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落);
4)加入含10%FBS的培养液1~1.5ml[培养液:胰酶=(2~3):1]中和胰酶;
5)轻轻吹打成单细胞悬液,吹打力度以不起气泡为宜;
6)将单细胞悬液吸入10~15ml离心管中,低速离心800rpm 3分钟,倒去上清液;
7)加入含10%FBS细胞培养液1~2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液;
8)吸取20ul细胞悬液(10ul细胞悬液+10ul台盼兰液:给坏死细胞染,判断细胞活力)至细胞计数板,进行细胞计数;
CCK-8实验:
9)在96孔板中,给每孔加100μL(约7000个)的细胞悬液,将培养板放在培养箱预培养24-72小时(37℃,碳酸氢钠溶液5%CO2),使细胞贴壁;
10)向培养板中加入10μL不同浓度(5八点听书、10、20、40、80、160ug/ml)的待测药物; 11)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时(例如:6、12、24或48小时)(药物起作用);
注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12)向每孔加入10μL(约10%) CCK-8溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数);
13)将培养板在培养箱内孵育1~4小时(半小时测一次OD值);
缘蝽科15)若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定,吸光度不会发生变化。
一域多层四四制测定待测定药物(6个浓度)对肺癌A549细胞增殖的影响,实验加样(最外围的36孔加PBS液,实际上可用60个孔):
分组 宣武区幼儿园 | | 浓度(ug/ml) |
实验组 A加药 | GO-CHI-HA-SNX-2112 细胞+培养基+药物+CCK-8 | 5 ●●● ●● | 10 ●●●●● | 20 ●●●●● | 40 ●●●●● | 80 ●●●●● | 160 ●●●●● |
A0加药 | 细胞+培养基+CCK-8,无药物 | ●●●●● | | | | | |
A空白 | 培养基+CCK-8,无细胞、药物 | ●●●●● | | | | | |
可不做 | 药物+培养基+CCK-8,无细胞 | 空气弹簧 ●●● ●● | ●●●●● | ●●●●● | ●●● | ●●●●● | ●●●●● |
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