【关键词】 蛋白酶激活受体 两国集团
【Abstract】 AIM: To investigate the actions of agonists of proteinase activated receptors (PAR)2 on the secretion of monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) from human lung epithelial cells. METHODS: A549 cells were cultured in a 12well culture plate. The challenge was performed by adding various concentrations of PAR2 agonists or their reverse peptides into each well， respectively. After 2 h， 8 h or 16 h， the reactions were terminated by removal of the supernatant from each well. A Sandwich ELISA was used to determine the levels of MCP1 in supernatants. RESULTS: Following 16 h incubation， PAR2 agonists SerLeuIleGlyLysValamide (SLIGKV) and transcinnamoylLeuIleGlyArgLeuOrnamide (tcLIGRLO) were able to induce concentration dependent secretion of MCP1. The maximum release of MCP1 was 13 fold more than the baseline release. The reverse PAR2 agonists had little effects on MCP1 release. The time course showed that the actions of PAR2 agonists initiated at 2 h and reached their peaks at 16 h. CONCLUSION: Agonists of PAR2 are potent secretogogues of MCP1 release from cu
2016年5月11日
ltured human lung epithelial cells. Their antagonists may possess the ability to inhibit airway inflammation. 【Keywords】 proteinaseactivated receptors；epithelial cell line; monocyte chemoattractant protein1 【摘要】 目的：探讨蛋白酶激活受体（PAR）2激动剂对人上皮细胞单核细胞趋化蛋白1（MCP1）分泌的影响. 方法：人肺上皮细胞系A549细胞分别接种于12孔培养板各孔内，并分别用不同浓度的PAR2激动剂，反PAR2激动剂进行刺激. 刺激时间为2， 8和16 h. 用ELISA方法检测上清液中的MCP1水平. 结果：经过16 h的培养，PAR2激动剂SLIGKV和tcLIGRLO均可引起浓度相关性MCP1释放增加，tcLIGRLO引起的最大MCP1释放量达基础分泌量的13倍. 反PAR2激动剂对MCP1释放的影响较小. 时间相关曲线表明，PAR2激动剂的作用从2 h开始，16 h达高峰. 结论：PAR2激动剂是高效的人肺上皮细胞MCP1的促分泌剂. 其拮抗剂有可能具有抑制呼吸道炎症的作用. 索爱z610
【关键词】 蛋白酶激活受体；上皮细胞系；单核细胞趋化蛋白1 0引言 上皮细胞可释放许多前炎因子［1］，作为首先接触吸入性抗原的呼吸道上皮细胞，能够释放许多与炎症性疾病密切相关的细胞因子，如MCP1，IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES和eotaxin等［2］. 最近发现在呼吸道上皮细胞上有PARs的表达［3］，提示在呼吸道上皮细胞的PARs和白介素分泌间可能有某种联系. 由于PAR2激活被发现与某些呼吸道炎症性疾病有关［4］，因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞探讨PAR2激动剂对上皮细胞MCP1释放的影响.
1材料和方法
1.1材料
PAR2激动剂SLIGKV，tcLIGRLO和反PAR2激动剂VKGILS，tcOLRGIL由美联生物科技有限公司（西安）合成; 青链霉素(Sigma公司);DMEM培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶EDTA消化液均购自Gibco公司.
1.2方法
人肺癌上皮细胞系A549细胞（购自中国科学院上海细胞研究所）接种于50 mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100 mL/L FBS，100 mg/L青/链霉素），于37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 待细胞铺满瓶底后，用2.5 g/L胰蛋白酶EDTA消化液消化，将获得的细胞分种于12孔培养板各孔内，用1 mL完全培养液培养至细胞相互融合后，换无血清培养液
培养16 h. 分5组：SLIGKV，tcLIGRLO，VKGILS，tcOLRGIL各1组和激发对照组. 激发实验向每孔内加0.1～100 μmol/L 4种浓度的PAR2激动剂或反PAR2激动剂，每种药物浓度重复2孔，分别培养2，8和16 h后收获上清液-80℃冻存，用于ELISA检测. 每组实验重复5次. 人MCP1检测用人MCP1 ELISA检测试剂盒（Biosource）， 检测上清液MCP1水平，并用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度A值.
统计学处理: 全部统计分析均采用SPSS(11.0版)软件分析，数据以x±s表示. 所用统计方法为单因素方差分析（one way ANOVA），组间方差不齐时，两两比较采用Dunnett’s T3检验；方差齐时，采用最小显著差法. P<0.05为统计学上有显著性差异.
2结果
培养16 h，PAR2激动剂SLIGKV和tcLIGRLO均可引起浓度相关性MCP1释放增加， tcLIGRLO在浓度1 μmol/L时就可引起MCP1释放增加， 增加到100 μmol/L时诱导MCP1的释放量比基础分泌量增加了13倍. 反PAR2激动剂tcOLRGIL在浓度为10 μmol/L时也能引起MCP1释放增加，但与同浓度的tcLIGRLO相比，诱导MCP1的释放量较少. SLIGKV在1 μmol/L时也可引起MCP1分泌增加，但它的作用强度比tcLIGRLO要弱，两者间有显著差异(P<0.05). 反PAR2激动剂VKGILS对MCP1的释放无影响（Fig 1）. tcLIGRLO与A549细胞
领土主权
培养2，8和16 h显示，随着药物作用时间的延长，MCP1释放量显著增加(P<0.05)，反PAR2激动剂tcOLRGIL随药物作用时间的延长，MCP1释放量也有少量增加（Tab 1）. SLIGKV引起MCP1释放也随时间而增加(P<0.05）.
3讨论
PARs属G蛋白耦联受体家族中的亚类，目前有PAR1，2，3，4四个成员组成，它的N末端可被丝氨酸蛋白酶裂解而成为一个新的可自我激活的系锁配体. 激活PAR2的蛋白酶主要有胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶及凝血因子Ⅶa，Ⅹa［5］. PAR2还可被与系锁配体结构一致的含5，6个氨基酸残基的多肽激活，主要有SLIGKV和tcLIGRLO［6］. MCP1属趋化因子CC亚家族中的一员，主要由上皮细胞、单核细胞、成纤维细胞等细胞产生，可以趋化激活T细胞和单核细胞，激活嗜碱性粒细胞，从而参与炎症过程.
PAR2激动剂对呼吸道上皮细胞MCP1分泌的促进作用表明在肥大细胞分泌的类胰蛋白酶和呼吸道上皮细胞之间存在着直接的联系，又一次间接证明了肥大细胞在哮喘和慢性阻塞性肺疾病的发病过程中起着一定的作用. PAR2激动剂可引起高达13倍的MCP1释放，表明蛋白酶对MCP1的释放促进作用是高效的，其诱导的MCP1释放量（600 ng/L）足以在体内引起炎症反应. 同时还提示一个更广义的概念，蛋白酶除了能够水解组织中的特异性底物外，
还可以通过PAR2受体刺激细胞分泌促炎介质，从而加重炎症的发展，为进一步理解炎症性介质间的相互作用提供了新的思路. tcLIGRLO比相同浓度的SLIGKV的作用强，除了其分子本身的作用外，可能与多肽上连上一个肉桂酰基而使该分子不易被细胞分泌的蛋白酶等水解有关. PAR2激动剂对MCP1分泌的刺激作用明显强于它们相对应的反肽，更说明这种刺激作用是具有特异性的，而不是对肽类的一种无选择性的反应. 从时间关系曲线上看，PAR2激动剂对MCP1分泌的刺激作用是一个比较缓慢的过程，这可能表明分泌出的MCP1是由上皮细胞新合成的，而不是原有贮存的MCP1的单纯释放. 但具体分泌机制还有待于进一步探索.
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