整合素α5β1介导细胞外信号调节激酶信号转导通路对A549细胞生长和侵袭的影响 白晶;钟小宁;唐海娟;何志义;张建全;邓静敏
【摘 要】Background and objective Recent studies have shown that integrin a5βl as a core in the integrin family plays an important role in metastasis, invasion and poor difference of non-small cell lung cancer. In this study, A549 cells were cultured and treated with integrin a5pβl small interfering RNA (siRNA) and extracelluar signal-regulated protein kinase (ERK) inhibitor PD98059 to investigate the effect of integrin aSpβ1 on proliferation and migration of A549 cells and explore its signal transduction mechanism. Methods A549 cells were divided into four groups: Untransfection, Lipofectamine, Integrin aSβ1 siRNA-transfected group and PD980S9 group. The protein expression levels of integrin aSβ1 were detected by Western blot analysis and the expression levels of integrin a5pβl mRNA was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein expression level of ERK1/2, MMP-9 and caspase-3 were measured by Western blot analysis. The proliferation and apoptosis of AS49 cells were measured by MTT assay and Annexin-V FIT
C PI double staining. Results Integrin a5β1 siRNA could inhibit the phosphorylated ratio of ERK by down-regulate the expression of ERK 1 /2 proteins. In addition, integrin a5βl siRNA or PD98059 could inhibit the proliferation of A549 cells, induce the apoptosis of A549 cells, up-regulate the expression of caspase-3 and down-regulate the expression of MMP-9. Conclusion Integrin a5β1 might involves the abnormal proliferation and migration of A549 cells through mediating ERK signal transduction pathway.%背景与目的近年研究显示整合素α5β1作为整合素家族的重要部分与非小细胞肺癌的转移性、浸润性和低分化趋向密切相关.本研究应用整合素α5/β1 siRNA双链及ERK抑制剂PD98095干预人肺癌细胞A549,探讨整合素α5β1蛋白表达对A549细胞生长和迁移能力的影响及其细胞内信号转导机制.方法实验分为未转染组、脂质体组、整合素α5β1 siRNA染组和PD98095组四组.采用免疫印迹(Western blot)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测A549中整合素α5β1蛋白和mRNA表达水平,Western blot检测A549中ERK1/2、MMP-9和caspase-3蛋白水平,四甲基偶氮唑盐比(MTT)法和Annexin-V FITC PI双染法检测A549增殖和凋亡.结果整合素α5/β1 siRNA双链在抑制α5/β1蛋白和mRNA表达的同时,可以下调ERK的mRNA和蛋白表达,并抑制其磷酸化水平.整合素α5/β1 siRNA双链和PD98059均可以明显抑制A549细胞的增殖,铁托
神狐海域
促进细胞凋亡和细胞内caspase-3蛋白表达,并抑制细胞内MMP-9蛋白表达.结论整合素α5β1可能通过介导的ERK信号转导通路参与了A549细胞的增殖和迁移调控.
【期刊名称】《中国肺癌杂志》
【年(卷),期】2011(014)007阿克毛事件
【总页数】7页(P568-574)
【关键词】整合素；A549细胞；ERK1/2(细胞外信号调节激酶1/2)
【作 者】如何增强班级凝聚力白晶;钟小宁;唐海娟;何志义;张建全;邓静敏
【作者单位】530021南宁,广西医科大学第一附属医院呼吸内科;530021南宁,广西医科大学第一附属医院呼吸内科;530021南宁,广西医科大学第一附属医院呼吸内科;530021南宁,广西医科大学第一附属医院呼吸内科;530021南宁,广西医科大学第一附属医院呼吸内科;530021南宁,广西医科大学第一附属医院呼吸内科
【正文语种】中 文
【中图分类】R743.2
整合素（integrin）是细胞粘附分子中一类重要的细胞表面受体家族，由α和β两个亚基组成的跨膜异二聚体，α和β亚基均由长的胞外区、跨膜区和短的胞内区组成，主要介导信息从细胞外基质向细胞内传递，调控细胞与胞外基质的粘附和细胞间的粘附，并参与调控细胞的增殖、分化、伸展与迁移等[1]。因此整合素的信息传递在促进肿瘤细胞失控制性生长、肿瘤细胞的去分化与远处转移发挥重要作用[2]。但是，对于整合素的细胞内外信号传导的具体过程及众多整合素相关蛋白的功能目前仍不十分清楚。整合素α5β1是整合素分子家族中重要的亚单位，能与不同的亚单位结合，构成细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的绝大多数受体。近年研究[3,4]显示整合素α5β1的高表达与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的转移性、浸润性和低分化趋向密切相关，是NSCLC患者预后不良的危险因素。细胞外信号调节激酶（extracelluar signal-regulated protein kinase,ERK）通路是细胞内重要的信号转导系统，可将胞外刺激信号转导至细胞及其核内，介导细胞生物学反应（如增殖、分化、转化及凋亡等）的过程，与肿瘤的发生发展密切相关[5]。整合素α5β1是否通过ERK1/2信号通路调控了肺癌细胞发生发展过程，目前尚无相关研究报道。本实验应用整合素α5/β1 siRNA双链及ERK抑制剂PD98095干预人肺癌细胞A549，旨在研
究整合素α5β1蛋白表达对A549细胞生长和迁移能力的影响及其细胞内机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 人肺癌细胞株A549由华中科技大学附属同济医院呼吸内科重点实验室赠送。RPMI-1640培养基购自Hyclone公司，OligofectamineTM和Opti-MEMI购自Carlsbad公司， 整合素α5/β1小片段干扰核糖核酸（small interfering RNA, siRNA）双链、兔抗人整合素α5、β1单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，新生牛血清和Trizol试剂盒购自Gibco公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司，碘化丙锭（propidium iodide, PI）购自Sigma公司，二甲基亚砜及噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT）均购自Clontech公司，ERK抑制剂（PD98095）购自美国CST公司，兔抗人磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）单克隆抗体、小鼠抗人ERK1/2单克隆抗体，小鼠抗人基质金属蛋白酶（matrix metalloprotease, MMP）-9单克隆抗体，兔抗人半胱天冬酶（caspase）-3单克隆抗体购自美国R＆D公司。TaqDNA聚合酶、莫洛尼(氏)鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus, M-MLV）、寡脱氧胸苷酸、核糖核酸酶抑制剂及琼脂糖均购自美国Promega公司，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）试剂盒，
整合素α5、整合素β1及内参磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）引物购自日本Takara公司，增强型ECL化学发光检测试剂盒购自美国Plierce公司。PCR和蛋白质印迹（Western blot）图像由Bio-Rad公司Gel Doc XR凝胶成像系统扫描，图像分析用Quantity One（version 4.6）分析软件完成。
1.2 细胞培养、分组 A549细胞用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基，于37 oC、5%CO2培养箱内培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。用瞬时转染方法特异性抑制整合素α5β1表达。利用ERK抑制剂PD98059抑制ERK的磷酸化。取对数生长期A549细胞接种，待细胞融合度达95%时，进行干预。将细胞分为4组：①未转染组：A549细胞不加任何干预；②脂质体组：A549细胞与Oligofectamine脂质体按比例混合；③整合素α5/β1 siRNA转染组：整合素α5和β1 siRNA与Oligofectamine脂质体按比例混合经Opti-MEMI稀释，加入培养好的细胞中，转染步骤按Santa Cruz公司说明书进行。转染培养6 h后，在荧光显微镜下观察，可见荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的siRNA转染的细胞转染成功。然后改为10%血清的RPMI-1640培养基继续培养18 h后应用RT-PCR和Werstern blot法检测RNA干扰效果；④PD98059组：A549细胞加入PD98059 10 μmol/L培养24 h。每组设4个复孔。
1.3 RT-PCR和Werstern blot法检测A549细胞中整合素α5β1蛋白和mRNA表达 转染24 h后分别提取总RNA、总蛋白。
首先将RNA逆转录成cDNA，随后PCR扩增。整合素α5基因片段，上游引物序列为5′-TCTGCCTCAATG CTTCTGG-3′，下游引物序列为5′-GTTGAGAGCGATG TGAATCG-3′，扩增片段248 bp。整合素β1基因片段，上游引物序列为5′-ACACGTCTCTCTCTGTCG-3′，下游引物序列为5′-CAGTTGTTACGGCACTCT-3′，扩增片段158 bp。GAPDH作为内参照，上游引物序列为：5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物序列为：5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'，扩增产物片段376 bp。PCR反应条件设置如下：94 oC预变性2 min，94 oC变性60 s，58 oC退火45 s，72 oC延伸1 min，35个循环。各取5 μL PCR产物与2 μL溴酚蓝混合后上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳。紫外光下观察并照相，采用软件分析目的基因和GAPDH条带的光密度（A）值，以同一管中目的基因和GAPDH产物条带A值之比作为反映目的基因mRNA表达水平的数据。
提取细胞总蛋白质后，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度以保证每个上样孔总蛋白量一致。蛋白变性、上样，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转膜，孵育
一抗（稀释比例1:1,000）、二抗（稀释比例1:2,000），ECL发光，胶片曝光。以β-actin作为内参照。胶片扫描并照相，测定各条带灰度值。以目的蛋白和β-actin条带A值之比作为反映目的蛋白表达水平。实验重复3次。
摩托罗拉mt8871.4 Western blot检测转染对ERK1/2蛋白表达的影响 收集细胞，采用Western blot检测ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达，一抗ERK1/2、p-ERK1/2按1:1,000稀释，方法同前。曝光后X光片用凝胶图像分析软件扫描，测定蛋白条带的灰度值。结果均用实际值与内参β-actin的比值（A%）表示，并计算ERK磷酸化，即p-ERK1/2蛋白占ERK1/2蛋白表达的百分率（%）。每组重复实验3次。
亚运会男足抽签
1.5 MTT法检测细胞增殖 96孔板内的A549培养结束4 h前，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），培养4 h后去培养液，加入150 μL二甲基亚砜充分溶解结晶物，采用酶标仪检测490 nm处吸光度A值。
1.6 Annexin-V FITC PI双染法检测细胞凋亡 收集细胞，磷酸盐缓冲液漂洗两次，加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温作用15 min，于流式细胞仪检测早期凋亡细胞百分率（Annexin V-FITC阳性，PI阴性）。
1.7 Western blot检测A549细胞中caspase-3、 MMP-9蛋白的表达 每孔取20 μg总蛋白加入等体积的上样缓冲液，煮沸变性10 min后，进行制胶、12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，泳闭，经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，封闭后，加入一抗（caspase-3、 MMP-9均按1:1,000稀释），4 oC孵育过夜，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记二抗（1:2,000稀释），室温摇床上孵育2 h，充分漂洗后按ECL发光试剂盒说明书操作，曝光后X光片用凝胶图像分析软件扫描，测定蛋白条带的灰度值。结果均用实际值与内参β-actin的比值（A%）表示。实验重复3次。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议