中国生物工程杂志China Biotechnology，2021，41(2/3) :7-13
DOI ： 10. 13523/j. cb. 2009002
刘美琴高博焦月盈李玮虞结梅彭向雷郑妍鹏付远辉何金生
(北京交通大学生命科学与生物工程研究院北京1_44)
摘要目的：探讨人呼吸道合胞体病毒（human respiratory syncytial virus，RSV)感染A549细胞的
长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)表达谱的差异，更好地了解宿主与R S V之间的 相互作用的可能分子机制。方法：1MOI R S V感染A549细胞,24h后提取R N A，利用A gilent的 IncRNA表达谱芯片，筛查了 R S V感染和未感染的A549细胞中的lnc.RNA差异表达谱，并进行实
时定量P C R验证，通过G O和K E G G对差异m R N A和IncR N A进行生物信息学分析。结果：RSV
感染的A549细胞与未感染的A549细胞相比，共有1 463个IncR N A和1552个m RN A s显著上
调，有944个IncRN A和1 489个m RN A s下调，差异表达IncRN A及其预测靶基因主要富集于免疫
应答过程。通过定量P C R证实所选丨n c R N A的表达谱结果。结论：R S V感染A549细胞后，IncRNA表达谱发生明显变化，对深入研究IncRN A如何参与R S V与宿主之间的相互作用奠定了
基础。
关键词人呼吸道合胞体病毒A549细胞长链非编码RNA表达谱
中图分类号Q812
人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,RSV)类属肺炎病毒科正肺病毒属，为单股负链 RNA病毒。R S V是引起婴幼儿下呼吸道感染的最重要 的病毒病原，老年人和存在免疫缺陷的病人也易遭受R S V引起的严重感染，且有感染史者易发生胂功能异常、支气管哮喘等肺部疾病。
铸炉之主派伦迪乌斯R SV感染细胞时，病毒包膜首先与其靶细胞膜发 生融合，病毒核衣壳被释放到细胞质，并启始病毒mRNA转录和病毒基因组复制。当宿主细胞通过模式 识别受体（pattern recognition receptors，PRRs)监测到病 毒相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，立即在病毒感染部位启动天然免疫反应，诱 导产生干扰素（interfemn，IFN)等细胞因子和抗病毒反 应。同时，像大多数病毒一样，通过多种免疫逃逸机制，R SV仍能感染宿主细胞，并进行有效复制n。
尽管我们对RSV与宿主相互作用已有了初步认
收稿日期:2020~09~01 修回日期:2020-1丨>04
*通讯作者，:jshhe@bjtu.edu，cn 识，但仍缺乏对R S V与宿主相互作用的全面理解，关于 R SV与宿主细胞相互作用的研究以往主要集中在RSV 与宿主蛋白的相关关系的研究[2]。近期研究表明，宿 主长链非编码 R N A(long noncoding R N A,IncR N A)亦 广泛参与调控细胞分化、组织生长、病毒与宿主相互作 用等，探讨IncRNA的作用机制成为当前研究的热点之 一[3]。本研究拟通过分析R S V感染的A549细胞中 IncR N A差异表达谱，为全面理解其在R S V与宿主的相 互作用提供新的有价值的线索。
1材料与方法
1.1细胞和病毒
A549 (由本实验室保存）用含10% F B S的DMEM (Gibco，美国）完全培养基培养于37丈、5%C02培养箱 中。R S V由北京首都儿科研究所钱渊教授馈赠，本实 验室保存。当A549细胞生长至80%密度，弃原培养 基，PBS洗潘 3 次，以感染复数（multiplicity of infection, M0I)为1的R SV感染A549细胞。待病毒吸附l h后，
中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.41 No.2/3 2021
加人含2%F B S的DMEM维持液，在37=€、5%C02培 养箱中培养。
1.2 RNA提取
R S V接种于A549细胞241】后，收集细胞，按照 PromegaZ3100SV Total RNA Isolation System(Proniega，美国）说明书提取总RNA：采用NanoDrop ND-1000 (Themm，美国）检测总K N A浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
1.3基因芯片检测lncRNA、mRNA及数据分析
使用基因芯片（Agilent IncRNA+ mRNA Human Gene Expression Microarray version4.0，美国）对 RSV 感 染的A549细胞进行ln(‘R N A和mRNA差异表达谱检测，使用 Agilent Feature Extraction software 对图像进行 分析、提取原始数据以芯片的所有基因表达信号值为堪础做H— 化处理，使用 Agilent GeneS|>ring s〇f't wai'f>并对数据进行分析。相对表达量变化倍数（fold change，FC) > 2 倍且 P<0_05 时，IncRNA 和 mRNA 被 认为存在显著差异使用Cluster 3. 0进行层次聚类，以显示差异表达的lm_R N A和mKNA。为了调查差异 表达IncRNA的潜在生物学功能和疾病类艰，对其进行
f G O分析和Pathway富集分析。
1.4 qRT-PCR验证
R S V接种于A549细胞24h后，收集细胞，按照 Trizol试剂（Invitrogen，美国）说明书提取总RNA。按照1.5 siRNA 转染
选取3对最重要的InHtNA-mRNA对，分别为P3377-OAS2、P13713-ELF3 及 P8610-BST2，每对都根据 4：补的lnd{N A序列设汁对应的SiRNA，将siRNA转染 至R SV感染的A549细胞中，敲掉IncRNA。转染过程 按照Entranster-IMXX)脂质体转染试剂盒说明书操作 转染后在A549细胞系中检测靶基因的表达水平，每组 都设置空白对照组和脂质体对照组。
2实验结果
2.1 IncRNA和m R N A组间差异表达分析
通过对原始数据进行提取、过滤、比对和差异表达分 析，按照P<〇.05且FC> 2标准，与未感染R SV的A549 细胞组相比，感染R SV的A549细胞组(3组）共有2 407 个IneRNAs和3 041个mRNAs差异表达。上调的IncRNAs和mRNAs的数量分别为1 463个和1 552个，下 调的IncRNAs和mRNAs的数量分别为944个和1 489 个表1显示了 R S V感染后A549细胞中10个上调和 下调最显著的IncRNAs，其中IncRNA上调最多的是ENST00000607613. 1(FC= 168. 389)，而 IncRNA下调 最多的是 ENST000005
20156. 1(FC= 22. 824)。表 2 显示 广KSV感染后A549细胞中10个上调和下调最显著的 mRNAs，其中上调最多的mRNA是NM_172139(FC= 4 903.417)，而下调最多的"1丨{1^是、\1_0010()5190
Tiangen SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒说（FC=34.342 )。层次聚类分析表明，与对照组中相应 明书进行qRT-PCR。P C K程序为：95丈变性15mm，的谱相比，K SV感染的A549细胞中有明显的IncRNA 951变性10s,60t退火/延伸2〇s，40个循环。使用 （图1a)和mRNA(图lb)表达谱u上述结果表明，RSV 2 _A A C T方法分析相对表达水平。感染后可调节A549细胞中的InrRNA表达水平。
表1与未感染的A549细胞相比，R SV感染的A549细胞中10个上调和下调最显著的IncRNAs Table 1Compared with uninfected A549 cells, the 10 most significantly up-regulated and down-regulated
IncRNAs in RSV-infected A549 cells
RSV感染的A549细胞中上调的IncRNAs R SV感染的A549细胞中下调的lnrRlNAs
IncRNA ID FC P value IncRNA ID FC P value ENST000007613.1168.3890. 000 594KNST00(X)()520156. 122.8240. 000 992 RNA147145 1 p0249_imsncRNA392117.7490.000083KNST0(X)(K)579368. 113.5280.000106 KNST00000415810. 192.4350.000213uc0101cl.311.7110.000 133 HIT
00007139485.8780.000213b：NST00000560973. 110.8480_006 189 uc003ylb. 182.1000. (X X) 424KNST00(XK)560237. 19.3440.000017 TCONS_0002705671.1460.000215KNST00000599209.18.8650.000839 XR_426856. 170.4060.0(X) 122XR_429553. 18.3070.000789 KNST00000600152. 166.5280. (K K) 038TCONS_0(X)282338. 1620.005 519 ENST00000592728. 165.0520. 000 355KNST00000521373. 17.9290. 003 902 ENST00000595705. 159.9270.001 780XR—247160. 17.4820.000099
2021,41(2/3) 刘美琴等：人呼吸道合胞病毒感染的A549细胞中长链非编码RNA表达谱研究9
表2与未感染的AS49细胞相比，R SV感染的A549细胞中丨0个上调和下调最显著的mRNAs
Table 2 Compared with uninfected A549 cells, the 10 most significantly up-regulated and down-
regulated mRNAs in RSV-infected A549 cells
KSV感染的A549细胞中上调的mRNAs RSV感染的A549细胞中下调的mRNAs Genbank Accession FC P value Genbank Accession FC lJ value
N M J72139 4 903.4170.000011NM_00100519034.3420.000026 NM_0010014371914.3440.000 012NM_01440514.0890.007145 N M J721401675.3460.000 076NM_20736213.1270.000356 NM.00
54091025.2580.000 089NM_00100192511•8400.000955 NM_017523469.6710.000 023NM_00114506410.6940.000069 NM_001565457.0130• 000 045NM_00497510.6570.000007 NM_00I565374.1100.000 019NM_02187110.4680.002490 NM_080657330.4060.000 049NM_00173610. 1470. 006 427圈一017523288.6320.000 007NM_0322949.2320.()00 058 XM_006724857278.8010.000 170NM_0143769.0770. 000 063
RSV
图1差异表达的IncRNA和mRNA聚类分析
Fig. 1Cluster analysis of differentially expressed IncRNA and mRNA江西理工大学学报
Compared with the control group, there are distinguishable hierarchical clustering of IncRNA (a)and mRNA ( b) expression profiles in aA549 cells infected with KSV. Higher and lower expression levels are represented as red and green, respectively
中国图学学会10
中国生物工程杂志China Biotechnology V «l . 41 No . 2/3 2021
2.2功能分析
首先利用miRanda 软件预测差异IncRNA 调控的
mRNA ，然后通过G O 富集IncRNA 调控的mRNA 在细胞定位及参与的生物学功能及过程，结果显示（图2a ),
wguUbor e r «9jta A 〇n n 〇lv«i9*n 〇m * n v w a l g e n o m e n «g a »m t o f v ra l rv sp o n s* to
re g u la tio n 〇t ty n ttk o sa e n c o n ip *s s <r >g m u lu a lftin ra p h c a b o r ie|>icarian c y c le
»n »riw 〇n ty p e I n ta rlM o n b g n a fe n g p a th w a y c»M a r i«p 〇nse to ly p * i r««r i**〇r w al q »n o m » rv p f c c a b o n rs g u L M o n o f w al p ro c M S re 〇u i a M >n 〇r w al p >o c e » c y to tu fV -m M M w J »g rta k n g p a itm a y c ««u lw r*sp 〇n 6» to c y to k v w sk m jlu s * re g u ta o o n o l m u fe -o ry a n sm p ro c M S V
w o u g p p araM sm rnponse lo c y M u n e la lio n o f M s q rd « m a c tu a to r a c tW y M «fle <o n -〇a n w n a n «9«»v « rv g u ta b o n o f C A lu ta r resp o n se to
k a a M *a w a M r actw y *rt«r1«u ia n -12 p ro d u c tio n h im lo m ttfttfo n -^ain m a d e te n *«rv sp o n set re i|>o «*e to x w u »r»s p o n s« lo v iru s • a c tw a b o n »r *g u la ta a n d n <«re g u U «〇〇M u a p o fK o k c i ■r w ttc a p to i
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Q O Q 04S 071 G O 1903901
G O 0034340 000060337
G
O 0071357 G O 0019079 G O .Q O O
G O 001« 00007” G O 0043901
Q O 000903 G O 0034097 G O 19D 3900 G O 0016004 0034341 0060??9
0032696
Q O 0071346 Q O O O S 160? G O 0035456
G O 0009615
G O 3 0000287 3 0019056
3 0036230
3 2000S 03 3 2000S 71
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(b )
图2 IncRNA 调控的m RNA 的G O 和pathway 富集分析结果
Fig. 2 GO and pathway enrichment analysis results of mRNA regulated by IncRNA
Compared with the control group, the GO enrichment analysis (a ) and KEGG pathway analysis ( b) of the differentially expressed mRNA regulated by IncRNA in A549 cells infected with
RSV
2021,41(2/3) 刘美琴等：人呼吸道合胞病毒感染的A 549细胞中长链非编码RNA 表达谱研究
11
10-qRT-PCR
Microarray
差异IncRNA 的靶基因高度富集在免疫反应（如I 型干 扰素信号转导途径、病毒基因组复制的负调控和宿主 抗病毒反应等）等生物学过程。Pathway 富集分析（图 2b )发现，排名靠前的IncRNA 调控的靶基因主要参与 干扰素信号转导途径和炎症反应等。上述结果表明， IncRNA 在R SV 感染细胞期间可能参与了抗病毒免疫 反应，以及宿主与病毒之间的相互作用。2.3 qR T -P C R 验证差异表达的IncRNA
生物信息学分析表明，共有18种IncRNAs (P 25918、P 38638_v 4、P 8612、P 8610、P 34527 _v 4、P 6011、 P 4480、P 13713、P 9969、PI 1891、P 17101、P 7539、P 8209、 P 34635 _ v 4、P 3377、P 30240、P 12897、P 8069 )和 5 个 mRNAs (ELF 3、USP 18、ICAM l 、BST 2、OAS 2)显著差异 表达，并与病毒繁殖和干扰素调节密切相关。因此，我 们于R SV 感染A 549细胞24h 后提取了 RNA ，采用qRT - PCR 检测了 18种IncRNAs 和5个mRNAs 的相对表达水 平，其表达分析结果与表达谱数据一致（图3、图4)。
ELF3 USP18 ICAM1 BST2 OAS2
图4 S 种显著差异表达的mRNAs
的qRT-PCR 验证结果
Fig. 4 The results of qRT-PCR verification of 5 significantly differentially expressed mRNAs
能分别是(MS 2和S S 72。
3讨论
R S V 感染宿主细胞后，能够引起广泛的转录组和
蛋白质组学改变，这既介导了宿主对R S V 感染的固有 免疫和适应性免疫反应，也反映了 R S V 能够规避宿主 应激反应。R S V 的融合糖蛋白（fusion glycoprotein ,F )、
黏膜糖蛋白（attachment glycoprotein ，G ) G )、基质蛋白 (matrix protein ，M )和非结构蛋白（nonstructural protein , NS )在调节宿主细胞功能、促进感染周期中发挥关键作 用[2]。例如，RSV NS 1和NS 2通过下调肿瘤坏死因子 受体相关因子 3 ( TNF receptor associated factor 3 , TRAF 3 )蛋白表达水平抑制I 型干扰素（type 1
interferon ,IFN )产生[4]。由于对R S V 与宿主相互作用 尚缺乏全面理解，而R S V 与宿主的相互作用对开发 R SV 疫苗和发展抗R S V 药物等至关重要，因而进一步 探讨R SV 与宿主相互作用，是亟待解决的问题。以往， 关于R S V 与宿主细胞相互作用的研究主要集中在RSV 与宿主蛋白质的相关关系上。近期研究表明，宿主 IncRNA 亦广泛参与调控细胞分化、组织生长、病毒与宿 主相互作用等，成为当前研究的热点之一 [3’5]。
IncRNA 是一类转录本长度超过200个核苷酸的 RN A 分子，参与了物种进化、胚胎发育、物质代谢和疾 病发生发展等过程。越来越多的研究表明，IncRNA 无 论是在DNA 病毒（如疱疹病毒）与宿主相互作用中，还 是在RNA 病毒（如人类免疫缺陷病毒和乙肝病毒）与 宿主相互作用中均扮演着重要角[5〜。病毒感染宿
2.4
用siR N 除IncK NA 分析具靶基因
qRT -P C R 验证过的18
个IncRNAs 和5个mRNAs 中，P 3377的靶基因可能是
0AS2, P 8610的靶基因可能是SS72。我们分别将 P 3377和P 8610的特异性siR N A 转染A 549细胞，24h
后确认敲低了 A 549细胞中的相应IncRNA 表达水平 后，于转染后72h ，检测A 549细胞中（M S 2的表达水 平。结果如图5所示，当敲低IncRNA P 3377和P8610 后，R SV 感染的A 549细胞中的（MS2和BS 72 mRNA 也 显著下调（P <〇.〇5)，表明P33T7和P8610的靶基因可
qRT-PCR
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图3 18种显著差异表达的丨ncRNAs 的
qRT-PCR 验证结果
Fig. 3 qRT-PCR results of 18 significantly
differentially expressed IncRNAs
A 敲IncR N A 其利用miRanda 软件发现，在qRT-PCR 【(^o w /A S D S )^°T 6c e e -g p o J
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