【目得】
1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白得操作技术。
2 。熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳得原理。
【原理】
带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反得电极移动，称为电泳.聚丙烯酰胺凝胶电泳( ＰAＧE ）就就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质得电泳.在电泳时，蛋白质在介质中得移动速率与其分子得大小，形状与所带得电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶就是一种人工合成得凝胶，就是由丙烯酰胺( Acｒ）单体与少量交联剂 N,Ｎ- 亚甲基双丙烯酰胺（Ｂis )在催化剂过硫酸铵( Ap ) 与加速剂四甲基乙二胺（ TＥＭＥＤ）得作用下发生聚合反应而制得得(其化学结构式见第 2 篇第 1 章)。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼得孔径大小可用改变凝胶液中单体得浓度或单体与交联剂得比例来加以控制.根据血清蛋白分子量得大小，学生实验一般选用7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质.
证据智能系统
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应与电荷效应得三重作用分离物质(见第 2 篇第１章), 使样品分离效果好, 分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图３-４ )，就是目前较好得支持介质，应用十分广泛.
图 3—4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
根据凝胶支持物得形状不同，分为垂直板电泳与盘状电泳两种，二者原理相同.本实验采用得盘状电泳就是在直立得玻璃管中，以孔径大小不同得聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质得不连续体系，使样品在不连续得两相间积聚浓缩(浓缩效应)成厚度为10 —2 cm 得起始区带，然后再利用分子筛 效应与电荷效应得双重作用在分离胶中进行电泳分离.
【器材】
1 .电泳仪
八数码问题直流稳压电源，电压 400 ~ ５00V ，电流５0mA .
２ .垂直管型圆盘电泳装置
二次沉淀池目前这类装置得种类很多，可根据不同得实验要求选择其中得一种。这类装置均由两个基本得部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～６
mm ），外径７~ 8mｍ，长８0 ～ 100ｍｍ得玻璃管作为材料，也可以使用更细得玻璃管.另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流(图３－5 ）。
图3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
（A 为正面, B 为剖面）
３。大号试管与中号试管
4 .微量移液器
５．５ml 注射器与9 号注射针头
6 。洗耳球、滤纸条、封口膜等
【试剂】
1 。丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺
一般性得分析工作，用分析纯得 Acr 与Ｂｉｓ即可，精细得分析工作，尤其就是分子量得测定与定量分析，需商品 Acr 与Ｂiｓ进行重结晶，进一步纯化.
2 . N ，N , N ’，Ｎ’ —四甲基乙二胺( ＴＥMED )
商品 TEMED 即可，低温，避光保存。
3 。 10％过硫酸铵溶液( AＰ , W/V ）
10g 过硫酸铵定容到１０ｍl ，最好使用新鲜配制得溶液。
4 .染液
取三200 g 加水 5０0ml ，然后加入 10 ｇ考马斯亮蓝 R 2５0 用玻璃棒搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至１00０ml 。
5 。脱液得配制
取三 100 g 加蒸馏水溶解后加至 100０ml 。
６ .储备液得配制
储液配制好后放冰箱４℃ 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。
7 .凝胶液得配制
开元释教录分离胶与浓缩胶得配制见下表:
8 。2０% 蔗糖
10０ml 取蔗糖 20g ，加少许蒸馏水溶解，最后加至 1００ mｌ。
9 ．加样缓冲液得配制 ( PH６、7 )
取 1mol 盐酸４、8 ｍｌ，Ｔris 0、６g , 20％蔗糖溶液 40ml ，加水至8０ml 充分混匀后，再加入 0、０2g 溴酚蓝， 4 ℃ 保存备用。
【操作】
1 。凝胶系统得聚合与制备
一般先制备分离胶，然后再在分离胶上面制作浓缩胶。
（ 1 ）电泳玻璃管得准备
取一根洁净得电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖得凹穴中或用封口膜密封，备用。
已经发生的未来( 2 ）分离胶（小孔胶)得制备
取分离胶 3mｌ放入试管，加入 10０μl 10% Ap 溶液混匀后使用.
厦门理工学院陈蕾用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内，当加到液面距离电泳玻璃管上口 2ｃm 时停止(约１、６mｌ)。注意在加得过程中不要混进空气，用过得注射器与针头要及时用水清洗，防止堵塞.
再在其上面小心覆盖 0、５cm 高得蒸馏水层（约 0、2ｍl )以隔绝空气，并防止柱表面得弯月面。加水过程中不要用力过猛，防止将液面胶液冲起。刚加入水层时在水层与胶面得交接处可见一明显得折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，应使玻璃管垂直静置约1５～20 分钟后，完成凝胶得聚合过程.然后用滤纸小心吸去表面得水层，切勿破坏胶面得完整性.
（３）浓缩胶（大孔胶）得制备
取浓缩胶 1ml 放入试管，加入 5０μl 10%Ap 溶液混匀后使用。
用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶得胶面，用滤纸吸取残留得缓冲液，滤纸尽量不要接触胶表面。
再加入约１ｃm 高得浓缩胶(约０、25ml ），表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水层时在水层与胶面得交接处可见一明显得折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合２0～３0 min 后除去上面得水层，同样不要破坏胶面得完整性。
吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口，在室温下放置1０~２０ min 后即可使用了。
2 ．样品得制备与点样
( 1 )样品得准备：取兔血清 0、5mｌ ，加入3mｌ加样缓冲液混合。可在 4 ℃ 冰箱保存 2 周.
（ 2 )点样：将制好得胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。然后分别在电泳槽得上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽得液面应没过玻璃管得下管口（注意不要有气泡存在）与电极丝；
上槽得液面应没过玻璃管口 0、５～ 1c ｍ。用微量注射器吸取５０μl 样品；标准蛋白样品 1 份（蛋白质含量1ｍg／ml ，溶于加样缓冲液中）小心得加入玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。
4 。电泳
（ 1 )电流电压条件
圆盘电泳：直流稳流电流强度通常为 4mＡ／管 .
( ２）电泳时间
一般约需 3 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约1cm 处时即可停止电泳。
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