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木质素纤维
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聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
【目的】
1 ． 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。
2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】
带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。 电视台
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂 过硫酸铵（ Ap ） 和加速剂 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好， 分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是 目前较好的支持介质， 应用十分广泛。 图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 晚钟 电影
根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。 白细胞介素12
【器材】
1 ．电泳仪
直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。
2 ．垂直管型圆盘电泳装置
目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽 。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流（图 3-5 ）。
图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A 为正面， B 为剖面 )
3 ．大号试管和中号试管
4 ．微量移液器
5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头
6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等
【试剂】
1 ．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺
一般性的分析工作，用分析纯的 Acr 和 Bis 即可，精细的分析工作，尤其是分子量的测定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶，进一步纯化。
2 ． N ， N ， N ＇， N ＇ — 四甲基乙二胺（ TEMED ）
商品 TEMED 即可，低温，避光保存。
3 ． 10% 过硫酸铵溶液（ AP ， W/V ）
10g 过硫酸铵定容到 10ml ，最好使用新鲜配制的溶液。
4 ．染液
取三 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至 1000ml 。
5 ．脱液的配制
取三 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。
平台期
6 ．储备液的配制
电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表：
浓缩胶 | 缓冲液 | Tris 5.98g 1mol/L HCl 48ml 加蒸馏水至 100ml | PH 6.7 |
凝胶储液 | Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml | |
分离胶 | 缓冲液 | Tris 36.3g 1mol/LHCl 48ml 加蒸馏水至 100ml | PH 8.9 不稳定的特里罗安 |
凝胶储液 | Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml | |
10 × 电极缓冲液 | Tris 6g Gly 28.8g 加蒸馏水至 1000ml | PH 8.3 |
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储液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。
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