技术领域
本发明属于医药领域，涉及芦丁的新用途，具体涉及预防或冠状病毒感染的医药用途。
背景技术
高致病性冠状病毒感染成了这十年来广受关注公共卫生问题。严重急性呼吸综合征 (SARS，2002-2004)，中东呼吸综合征(MERS，2012-至今)，2019新型冠状病毒2019-nCov(COVID-19)感染，每一个对人类健康，经济发展都带了巨大的冲击。
由于没有针对性的有效药物和疫苗，新型冠状病毒的新药研发意义重大，在这场没有硝烟的战争中，全球多家科研机构和制药公司致力于研发新型冠状病毒疫苗和药物。因此发明具有重大的社会学和经济学意义。 张玉舜芦丁，Rutin，又称为芸香甙，维生素P，紫槲皮甙，路丁，路丁粉，路通，络通，紫皮甙。来源：芸香叶、烟叶、枣、杏、橙皮、番茄、荞麦花等中。芦丁有以下作用：1.可用作食用
抗氧化剂和营养增强剂等。2.芦丁有维生素P样作用和抗炎作用，能降低如芥子油对动物眼睛或皮肤引起的炎症。有强烈的抗氧性，把芦丁加入富于溶酶体的匀浆内，能抑制类脂质过氧化物的形成。能强烈吸收在280～335nm的紫外线，可用于防晒增白型化妆品。3.具有维持血管抵抗力、降低其通透性、减少脆性等作用。可用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等疾病。
芦丁是一种分布广泛的黄酮类化合物，这类化合物主要存在于槐米、芸香、荞麦、沙棘、山楂、桉树叶和烟叶等多种植物中，其中以槐米、荞麦、桉树叶含量最高，可作为提取芦丁的原料。此外，它还存在于冬青科植物毛冬青、木樨科植物连翘、豆科植物槐角以及烟草、枣、杏、橙皮和番茄等植物中。目前，我国芦丁生产主要以槐米(槐米是槐花的花蕾，槐米中的芦丁随槐花的产地及收取时问的不同其含量在10％～28％之间)为原料进行提取。
发明内容
本发明的目的在于提供包括2019新型冠状病毒(COVID-19)在内的冠状病毒的有效抑制剂，可以预防及包括2019新型冠状病毒在内的冠状病毒。本发明提供了一种芦丁的新用途，作为包括2019新型冠状病毒在内的冠状病毒的有效抑制剂，在制备预防或冠状病
毒感染的药物中的应用。
所述的应用，其中冠状病毒包括2019新型冠状病毒(COVID-19)、严重急性呼吸综合症(SARS)病毒、中东呼吸综合症(MERS)病毒以及普通感冒人冠状病毒 OC43(HCoV-OC43)，还包括人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒 229E(HCoV-229E)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)。
所述的应用，其中冠状病毒为2019新型冠状病毒(COVID-19)。
所述的应用，其中冠状病毒感染为冠状病毒肺炎或者普通感冒。
所述的应用，其中冠状病毒感染包括2019新型冠状病毒COVID-19肺炎、严重急性呼吸综合症SARS、中东呼吸综合症MERS、普通感冒、人冠状病毒NL63肺炎、人冠状病毒229E肺炎、人冠状病毒HKU1肺炎。
所述的应用，其中冠状病毒感染为2019新型冠状病毒肺炎。
本发明人经过大量研究发现芦丁的新用途，芦丁可以结合2019新型冠状病毒的刺突蛋白 S 1，冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)以及木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)，既能够阻断病毒进入细胞，又能够抑制病毒复制。芦丁在细胞水平上EC50＝0.2511uM。 2019新型冠状病毒进入细胞靠刺突蛋白spike识别受体ACE2,两种参与2019-nCov蛋白酶解过程的关键蛋白酶分别为冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)。因此，针对spike,3CLpro和PLpro三种蛋白为靶点的小分子抑制剂可应用于针对新型冠状病毒的。
本发明人还发现芦丁对SARS和MERS的S1/3CL/PLP靶蛋白同样能有效结合，还发现芦丁能抑制冠状病毒NL63进入肺类器官，因此芦丁是冠状病毒科的广谱抑制剂。
本发明的化合物可以配制成各种适合的药物制剂形式。可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等或注射给药的粉针剂、溶液剂。
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与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
芦丁在细胞水平能够通过阻止病毒进入细胞以及抑制主蛋白酶(3CLpro)和木瓜蛋白酶样蛋
白酶(PLpro)，明显的抑制病毒的复制，从而达到预防和冠状病毒感染的作用，尤其是涉及2019新型冠状病毒、严重急性呼吸综合症病毒或中东呼吸综合症病毒的感染。
附图说明
图1 2019nCoV Spike S1&rutin传感图
芦丁和2019新型冠状病毒刺突蛋白(spike S1)的亲和力。
图2 2019-nCoV Spike S1 RBD&rutin传感图
芦丁和2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(spike S1 RBD)的亲和力。
图3 2019-n CoV 3CL&Rutin传感图
芦丁和2019新型冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)的亲和力。
图4 2019-nCoV PLP&Rutin传感图
芦丁和2019新型冠状病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)的亲和力。
图5SARS Spike S1&rutin传感图
芦丁和SARS冠状病毒刺突蛋白(spike S1)的亲和力。
图6MERS Spike S1&rutin传感图
芦丁和MERS冠状病毒刺突蛋白(spike S1)的亲和力。
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图7SARS PLP&rutin传感图
芦丁和SARS冠状病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)的亲和力。
图8MERS 3CL&rutin传感图
芦丁和MERS冠状病毒主蛋白酶(3CL)的亲和力。
图9 2019-nCoV 3CL&hyperoside传感图
金丝桃苷和2019新型冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)的亲和力。
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如来神掌之宇宙争雄图10MERS 3CL&hyperoside传感图
金丝桃苷和MERS冠状病毒主蛋白酶(3CL)的亲和力。
图11 2019-nCoV 3CL&Forsythoside E传感图
连翘酯苷E和2019新型冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)的亲和力。
图12MERS 3CL&Forsythoside E传感图
连翘酯苷E和MERS冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)的亲和力。
图13SARS PLP&Forsythoside A传感图
连翘酯苷A和SARS冠状病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)的亲和力。
图14MERS 3CL&Forsythoside A传感图
连翘酯苷A和MERS冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)的亲和力。
图15芦丁抑制2019新型冠状病毒3CL和PLP蛋白酶的半抑制浓度(IC 50)
荧光共振能量转移(FRET)法检测芦丁对2019新型冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)细胞外蛋白酶切活性的影响。
图16芦丁抑制MERS冠状病毒3CL蛋白酶的半抑制浓度(IC 50)
箭头卡环荧光共振能量转移(FRET)法检测芦丁对MERS冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)细胞外蛋白酶切活性的影响。
图17芦丁抑制2019新型冠状病毒假病毒进入细胞的半最大效应浓度(EC 50)
2019新型冠状病毒假病毒中和实验检测芦丁抑制假病毒进入细胞的效果。
图18阳参抑制2019新型冠状病毒假病毒进入细胞的半最大效应浓度(EC 50)
图19肺气管器官模型的构建
图20芦丁抑制冠状病毒NL63进入肺类器官模型的效果
具体实施方式
下面结合具体实验操作及数据，进一步说明本方面的技术方案。
以下通过试验说明芦丁对2019新型冠状病毒的抑制作用。
芦丁母液(10mM)购买于MCE公司,货号(HY-N0148)，芦丁粉末购买于索来宝公司，货号(SR8250,100mg)。
实施例1冠状病毒SPR实验
实验材料与仪器
biacore T200(GE healthcare,Uppsala,Sweden),CM5芯片(GE healthcare,Uppsala,Sweden)，芦丁(MCE公司)，2019-CoV S1蛋白(义翘神州)，2019-CoV S1 RBD蛋白(近岸蛋白)， 2019-CoV 3CL蛋白(近岸蛋白)，2019-CoV pL蛋白(近岸蛋白)
2019新冠病毒S1蛋白SPR实验
机型为GE公司的biacore T200,将2019新型冠状病毒的S1蛋白(义翘神州)通过氨基偶联到C
M5芯片上，偶联量为9499.3RU,测量芦丁和S1蛋白在25℃下的亲和力。以30μL/分钟的流速以50uM,25uM,12.5uM,6.25uM,3.125uM，1.5625uM,0.78125uM,0uM的浓度注入芦丁(MCE),进样时间180s,解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。结果见图1。
2019新冠病毒S1 RBD蛋白SPR实验
机型为GE公司的biacore T200,将2019新型冠状病毒的S1 RBD蛋白(近岸蛋白)通过氨基偶联到CM5芯片上，偶联量为10043.5RU,测量芦丁和S1蛋白在25℃下的亲和力。以30μL/分钟的流速以100uM,50uM,25uM,12.5uM,6.25uM,3.125uM,1.5625uM,0.78125uM,0.390625uM,0uM的浓度注入芦丁(MCE)，进样时间180s,解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。结果见图2。
2019新冠病毒3CL蛋白SPR实验
机型为GE公司的biacore T200,将2019新型冠状病毒的3CL蛋白(近岸蛋白)通过氨基偶联到CM5芯片上，偶联量为10125.4RU,测量芦丁和3CL蛋白在25℃下的亲和力。以30μL/ 分钟
的流速以100uM,50uM,25uM,12.5uM,6.25uM,3.125uM，1.5625uM,0uM的浓度注入芦丁(MCE),进样时间180s,解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。结果见图3。
2019新冠病毒PLP蛋白SPR实验
机型为GE公司的biacore T200,将2019新型冠状病毒的PLP蛋白(近岸蛋白)通过氨基偶联到CM5芯片上，偶联量为15846.8RU,测量芦丁和PLP蛋白在25℃下的亲和力。以30μL/ 分钟的流速以100uM,50uM,25uM,12.5uM,6.25uM,3.125uM，1.5625uM,0uM的浓度注入芦丁(MCE),进样时间180s,解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。结果见图4。
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