以蛋⽩受体结合区为靶点研发SARS疫苗Xiaojie Zhu 1 , Qi Liu 2 , Lanying Du 3 , Lu Lu 1 , Shibo Jiang 4 1 Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Shanghai Medical College and Institute of Medical Microbiology, Fudan University, Shanghai, China
2 Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Shanghai Medical College and Institute of Medical Microbiology, Fudan University, Shanghai, China; Department of Medical Microbiology and Immunology, School of Basic Medicine, Dali University, Dali, China
3 Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center, New York, USA
4 Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Shanghai Medical College and Institute of Medical Microbiology, Fudan University, Shanghai, China; Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center, New York, USA
关键词：病毒 SARS冠状病毒受体结合区域突起蛋⽩疫苗 摘要
10年前，严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（SARS-CoV）造成了世界范围的流⾏爆发，其死亡率为10%。最近爆发的由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）导致的类SARS 的报道引起了⼈们密切关注，⼈们担⼼SARS-CoV是否有可能经实验室逃逸或⾃然宿主⽽再次爆发。故⽽，研发有效并安全的SARS疫苗仍有必要。基于我们以往的研究，我们认为位于SARS-CoV spike（S）蛋⽩S1亚基的受体结合区（RBD）是研发SARS疫苗最重要的靶点。尤其是S蛋⽩的RBD含有关键中和区（CND），CND可以诱发强效的中和抗体反应以及对SARS-CoV变异株的交叉保护。此外，以RBD为基础的亚基疫苗有望⽐其他疫苗更安全，不会引起2型免疫反应。本⽂将讨论以RBD为基础的SARS疫苗研发的关键进展，以及⽤同样⽅法研发MERS-CoV疫苗的可能性。 导⾔
2002年末，中国⼴东省出现了新型⼈冠状病毒（SARS-CoV）引起的重症急性呼吸综合征（SARS）。⾄2003年底，已经播散⾄30多个国家，8096⼈受累，其中774例死亡（致死率约10%）（1-3）。尽管在2003年7⽉已控制住世界范围SARS的流⾏，但2003年末⾄2004年初中国散发的病例报道（4）引起了⼈们的关注，⼈们担⼼SARS-CoV 通过动物源性或实验室逃逸（5,6）导致SARS再次爆发。
最近有⼀种与SARS冠状病毒密切相关的病毒—中东呼吸综合征冠状病毒—已经被证实是导致类SARS
爆发的病原体，该病毒在中东、欧洲、⾮洲造成的感染死亡率为55%。这些报道引起了关于SARS冠状病毒是否可能复燃的关注，并且促进了有效安全的SARS疫苗发展，以便对付未来的任何SARS流⾏。
明确SARS-CoV spike蛋⽩上的受体蛋⽩结合区（RBD）及其在病毒进⼊靶细胞过程中的地位
SARS-CoV是⼀种单链，不分节段，有包膜的正链RNA病毒。其基因组RNA包含29,736个核苷酸，基因组的前2/3（5′端）编码⾮结构RNA复制酶蛋⽩，基因组的后1/3（3′端）编码结构蛋⽩，包括刺突蛋⽩（S），包膜蛋⽩（E），膜蛋⽩（M），以及核⾐壳（N）蛋⽩（11）。SARS-CoV的S蛋⽩是⼀种I型跨膜糖蛋⽩（Env），在受体结合、膜融合、病毒⼊侵⽅⾯起重要的作⽤。SARS-CoV通过S蛋⽩与其细胞受体⾎管紧张素转换酶2（ACE2）结合⽽启动⼊侵细胞的过程（12）。然后，病毒-ACE2复合体转移⾄内涵体。组织蛋⽩酶L抑制剂可以明显抑制SARS-CoV的进⼊，提⽰S蛋⽩是通过内涵体酸性蛋⽩酶（组织蛋⽩酶L）来激活其融合活性（13）。融合肽（FP）插⼊内涵体膜后，S蛋⽩的七肽重复区1和2（HR1和HR2）相互结合形成⼀个六螺旋束（6-HB）核⼼，6-HB核⼼进⽽使病毒包膜和胞浆膜贴近以便融合。然后病毒RNA基因组释放⾄胞浆（14,15）（图1）。另外，SARS-CoV也可以类似HIV的⽅式经胞浆膜融合进⼊靶细胞。SARS-CoV S蛋⽩的S1亚基与ACE2结合后，S2亚基通过将融合肽插⼊胞浆膜⽽改变构象。HR2区域与HR1三聚体形成6-HB核⼼，导致病毒包膜和细胞胞浆膜融合（16）。
图1 SARS-CoV⼊侵靶细胞模型。（A）SARS-CoV主要通过包内体膜融合（左侧）还可通过胞浆膜融合（右侧）侵⼊靶细胞（16）;（B）SARS-CoV S蛋⽩的HR1和HR2区构成融合核⼼结构；融合核⼼是⼀个六螺旋束（6-HB），其中3个HR2α螺旋以倾斜反相平⾏的⽅式对于中⼼HR1三聚体表⾯的疏⽔区（17）。
随后，RNA基因组以⾃⼰为模板合成全长及亚基因组长度的负链RNA，负链RNA⼜以⾃⼰为模板合成mRNA。病毒蛋⽩被翻译出来并转送⾄内质⽹-⾼尔基中间腔室（ERGIC）内（18）。胞浆的RNA基因组和N蛋⽩汇组成病毒核⾐壳。经胞吐作⽤，病毒粒⼦从细胞释放出来（图2）。
图2 SARS-CoV的⽣命周期。SARS-CoV以结合病毒粒⼦开始⽣命周期，由S蛋⽩到靶细胞的ACE2受体（12），病毒粒⼦经胞吞作⽤进⼊细胞。S蛋⽩改变构象以利包内膜融合并释放RNA 基因组到靶细胞。经过复制和翻译，病毒结构、⾮结构蛋⽩和基因组RNA收集到病毒粒⼦，病毒粒⼦再以囊泡转运并释放出靶细胞（5）。
SARS-CoV S蛋⽩由负责受体结合的S1表⾯亚基和介导膜融合的S2跨膜亚基组成。跨接S1亚基318-510残基的⼀个⽚段便是最⼩RBD（19,20）。RBD包含⼀个环部位（424-494区域），命名为受体结合基序（RBM）（图3A），它可以与受体ACE2完全接触。有趣的是，RBM部位富含酪氨酸。直接接触ACE2的14个RBM残基中有6个是酪氨酸。RBM的两个残基，Asn479和Thr487，决定SARS疾病的
进展以及SARS-CoV的嗜性（22,23）。替换这两个残基可以改变该病毒从动物到⼈或⼈与⼈之间的传染性（图3B）（21）。RBD部位的多个半胱氨酸残基对维持SARS-CoV（21）和MERS-CoV（24）RBDs的功能性构象有着重要的作⽤。
图3 SARS-CoV S蛋⽩的结构和功能。（A）SARS-CoV S蛋⽩的功能区；SP，信号肽；RBD，受体结合区；RBM，受体结合基序；FP，融合肽；HR，七肽重复区；TM，跨膜区；CP，胞浆区。每个区域的残基数字代表其在SARS-CoV S蛋⽩的位置。（B）RBD/ACE2复合体的晶体结构中，SARS-CoV S-RBD（绿）与 ACE2（红）的相互作⽤（12,20,21）。RBD中可以诱导强效和⼴泛的抗体中和作⽤的关键中和域（CND）
我们的既往研究已经显⽰，从SARS患者及灭活SARS-CoV疫苗接种的动物中分离的抗⾎清可以与SARS-CoV S蛋⽩的RBD起明显的反应，提⽰RBD拥有强效的中和作⽤（25）。免疫吸附耗尽患者或兔免疫⾎清中的RBD特异性抗体，导致⾎清介导的中和活性明显下降（26）。SARS-CoV的抗⾎清提纯的抗体明显抑制RBD结合ACE2，并且亲和纯化的抗RBD抗体显⽰出相对更强的中和感染性的能⼒（26,27）。所有这些结果提⽰，S蛋⽩的RBD含有CND，且RBD 可进⼀步作为免疫原⽤于诱导产⽣针对SARS-CoV的中和抗体。
以前我们发现在RBD中单⼀的氨基酸置换，⽐如R441A，⾜以消除RBD在接种的⼩⿏和兔中诱导中和
抗体的免疫原性，有R441A突变的RBD不能结合游离的和细胞相关的ACE2，提⽰RBD 中RBM的⼀些关键残基同样也是CND中的关键残基。不过，就像Ye et al.描述的，RBM的
R453A突变清除了病毒的⼊侵能⼒，但保留了诱导中和抗体产⽣的能⼒，提⽰CND的某些残基可能不参与RBD-受体相互作⽤（28）。
司礼监
⽤嵌合IgG Fc的RBD（RBD-Fc）接种⼩⿏，从它们体内分离出⼀组27个RBD特异性单克隆抗体（mAbs）。其中，mAbs 4D5和17H9可以识别RBD线性抗原表位，但未显⽰出中和活性。采⽤竞争结合试验，其余的25个RBD特异性mAbs可以根据他们识别的RBD抗原表位的构象分为6组（i.e., Conf I-VI）（图4）。我们发现只有识别Conf IV和V的mAbs可以有效的阻⽌RBD与ACE2结合，提⽰其抗原表位与RBD-ACE2相互作⽤有关。识别Conf I和II的mAbs对RBD与ACE2结合没有明显影响。但它们仍具有强效的中和活性，提⽰这些mAbs能通过RBD-ACE2相互作⽤以外的途径抑制SARS-CoV感染（27）。这些发现显⽰SARS-CoV S蛋⽩RBD含有多种构象表位，可以导致强效的中和反应，并且可以进⼀步作为靶点来研发SARS疫苗。 图4 竞争结合试验明确的RBD特异性mAbs的特异性抗原抗原。竞争结合试验⽤⽣物素标记的mAbs作为探针，明确可以识别RBD不同构象的抗原抗原的mAbs特征。例如，mAbs 10E7和45B5⽣物素化后，则可测定结合10E7-biotin和45B5-biotin的25构象特异性mAbs对RBD的的抑制活性。24H8和31H
12均可有效阻滞10E7-biotin与RBD结合，31H12也可以抑制45B5-biotin与RBD结合。这些结果显⽰mAbs 24H8和10E7享有同样的抗原抗原（Conf I），⽽31H12能结合10E7和45B5均能识别的抗原抗原（Conf II）。同理，这25个构象特异性mAbs可以分到6个不同的竞争组（Conf I-VI）（27）。
以RBD为基础的SARS疫苗
尽管以灭活病毒、DNA、病毒载体为基础的试验疫苗可以诱导有效的中和抗体反应，但他们的安全性在进⼀步研究中是最⼤的问题。⼀种双灭活的SARS-CoV疫苗已证明可诱导嗜酸性粒细胞增多及免疫病理学改变（29）。该灭活疫苗中SARS-CoV的核⾐壳蛋⽩（NP）可对此不良后果负责（30,31）。全长S蛋⽩可能也不安全。例如，包含重组S蛋⽩的试验疫苗在接种动物⾝上能引起Th2介导的免疫反应（32）或⼀些免疫增强反应（33）。
基于我们以往的研究，我们相信以RBD为基础的SARS疫苗是最有效和最安全的。⾸先，我们已经证实重组了⼈类IgG Fc⽚段的RBD（RBD-Fc）能在哺乳动物细胞中表达，并能在免疫⼩⿏和兔⼦的体内诱导产⽣强效的中和抗体（34）。其次，在哺乳动物（293T）细胞、昆⾍
（Sf9）细胞，以及E. Coli重组表达的⽆Fc⽚段的RBD, 均诱导⾼效的中和抗体反应，并在⼩⿏⾝上对SARS-CoV产⽣完全的保护免疫。第三，⼀个在中国仓⿏卵巢（CHO）-K1细胞表达的219⽚段（残基318-536）RBD蛋⽩以及⼀个在CHO细胞稳定表达的193⽚段（残基318-510）（RBD193-CHO）可
以诱导很强的细胞及体液免疫反应，对所有免疫的⼩⿏都能产⽣保护作⽤（35,36）。第四，⼀种以腺伴随病毒（rAAV）为基础重组的RBD（RBD-rAAV）疫苗能在肌注疫苗的BALB/c⼩⿏⾝上诱导产⽣有中和活性的体液免疫反应（37）。RBD-rAAV疫苗滴⿐使⽤⽐肌注能诱导产⽣更强的SARS-CoV特异性系统及粘膜免疫反应（38）。第五，初始给予RBD-rAAV疫苗，并以T细胞抗原决定基的RBD特异性肽加强能明显提⾼抗SARS-CoV的体液和细胞免疫反应（39）。第六，以RBD为基础的SARS疫苗能在动物模型上诱导产⽣具有长期中和活性和长期保护性免疫的⾼滴度S特异性抗体（40）。所有这些结果提⽰，以RBD为基础的疫苗作为有效和安全的疫苗，对预防SARS-CoV感染及在将来控制SARS复发流⾏⽅⾯有良好的研发前景。
结论与前景
结合最近MERS-CoV引起的类SARS疾病的出现以及未来SARS复发的可能，研发有效、安全的针对SARS-CoV的疫苗有很⼤意义。我们过去的研究已经显⽰，SARS-CoV S蛋⽩的S1亚基上的RBD包含有CND，可以诱导强有⼒的体液及细胞免疫反应，尤其是交叉中和抗体和强有⼒的保护免疫。所以，以RBD为基础的疫苗对研发作为将来有效的SARS疫苗值得考虑。进⽽，这种策略可以为针对其他含I型膜融合蛋⽩的包膜病毒感染疫苗的研发提供借鉴，这些病毒包括
H7N9病毒（41-43）和MERS-CoV（7,24）。
最近，Chan等（44）⽤中和抗体试验和免疫荧光⽅法检测到恢复期SARS患者收集的⾎清可能含对MERS-CoV有交叉反应的抗体。利⽤⽣物信息学分析，他们推测诱导交叉反应抗体的B细胞抗原决定基可能位于MERS-CoV的S2亚基HR2区域。不久前，我们发现SARS-CoV S蛋⽩RBD特异性mAbs未显⽰出针对MERS-CoV的交叉反应或交叉中和活性，提⽰SARS-CoV 和MERS-CoV S蛋⽩RBD可能不包含诱导交叉活性抗体反应的抗原决定基（45）。故⽽，计划并研发针对MERS-CoV的以RBD为基础的疫苗，需借鉴我们以RBD为基础针对SARS疫苗的⼀些经验路径。
致谢
本研究受中国973计划（#2012CB519001）基⾦⽀持，中国科学技术部，⾹港，澳门，台湾合作计划（201200007673），及美国NIH（R01 AI098775）。
河南网通宽带声明：作者宣称没有利益冲突。
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