（修订版2020年5月7日）
一、待测样品预处理
称取鲜样0.5g于预冷的研钵（提前放冰箱）中，加1mL预冷的磷酸缓冲液（0.05mol/L， pH=7.8），冰浴研磨后再加1mL缓冲液，倒入离心管中，再用2mL缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（0-4℃）离心20min（10500rpm），收集上清液，冷藏保存。
磷酸缓冲液配制：
A液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）的配制：称取Na2HPO4·2H2O 35.61g 或Na2HPO4·7H2O 53.65g 或Na2HPO4·12H2笛卡儿积O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。
B液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）的配制：称取NaH2PO4·H2O 27.6g 或NaH2PO4·2H2O 31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。
磷酸缓冲液（0.05mol/L， pH=7.8）配制：45.75mL A + 4.25mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（0.1mol/L， pH=7.0）配制：61mL A + 39mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（100 mmol/L、pH 7.5）配制：84mL A + 16mL B定容至200mL。
磷酸缓冲液（50 mmol/L、pH7.5 ）配制：42mL A + 8mL B定容至200mL。
pH | 5.8 | 烟气烟碱量 6.0 | 6.5 | 6.8 | 7.0 | 7.5 | 7.6 | 7.7 | 7.8 | 7.9 钻井泥浆材料 | 8.0 |
x(mL)A | 8.0 | 12.3 | 31.5 | 49.0 | 61.0 | 84.0 | 87.0 | 89.5 | 91.5 | 93.0 | 94.7 |
y(mL)B | 92.0 | 87.7 | 68.5 | 51.0 | 39.0 | 16.0 | 13.0 | 10.5 | 8.5 | 7.0 | 53 |
| | | | | | | | | | | |
二、SOD（超氧化物歧化酶）活力测定——氮蓝四唑（NBT）法
1.1 原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动､植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：。本反应产物H2O2 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是，光还原反应后，反应液蓝愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小｡ 1.2 试剂配制
2.2.1 磷酸缓冲液配制
A：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（A液）的配制：称取Na2HPO4·2H2O 35.61g 或Na2HPO4·7H2O 53.65g 或Na2HPO4·12H2O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。
B：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（B液）的配制：称取NaH2PO4·H2O 27.6g 或NaH2PO4·2H2O 31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。
2.2.2 反应液的配制（测定前现配现用）
反应液——水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD（核黄素）=5:30:6:6:6:6；
49mL 反应液组成：水5mL，50mM磷酸缓冲液30mL，Met 6 mL， NBT 6 mL， EDTA-Na2 6 mL，FD 6 mL。
其中：
1 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液的配制：称取1.9399g Met 用pH7.8 磷酸缓冲液定容至100mL，摇匀备用。
2 750umol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液的配制：称取0.06133g NBT用pH7.8 磷酸缓冲液定容至100mL，摇匀备用，避光保存。
3 100µmol/L EDTA-Na2溶液的配制：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000mL，摇匀备用｡
4 20 µmol/L核黄素溶液： 称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL，摇匀，避光保存｡
1.3 方法
取相同型号的试管，试管中加入50µL上清液 （空白对照加磷酸缓冲液50µL），分别加3mL反应液，其中2支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx 日光下反应20-30min（要求各管受光情况一致，温度高时反应时间短，温度低时延长），反应结束后，以不照光的对照试管作空白，于560nm下比测定吸光度值。
计算公式： 以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为1个酶活单位（U），按下式计算SOD活性。
SOD总活性（U·g-1 FW）=（Ack - As）×V/（Ack×0.5×FW×V1）
式中：
Ack——照光对照管的吸光度
As——样品管的吸光度
V——样品总体积（本试验中为 4mL），mL
FW ——样品鲜重（本试验中为 0.5g）
V1 ——测定时样品的用量，mL
1.4 注意事项
（1）核黄素产生，NBT 还原为蓝的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。
（2）植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。
（3）测定SOD活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。
三、 POD（过氧化物酶）：愈创木酚法
1. 测定方法
取上清液20µL加入比杯中（对照加20µL磷酸缓冲液），加3mL反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1分钟读一次（读0,1,2,3min的OD值）。
反应液的配制：0.1mol/L pH=6.0的磷酸缓冲液50ml，加愈创木酚28µl，于磁力搅拌器上加热溶解，冷却后加30%双氧水19µL存于冰箱中备用。
2. 计算公式
（1）以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔOD470·min-1·g-1 FW表示之。低碳哥
POD总活性（ΔOD470·min-1·g-1 FW）=（ΔOD470×V）/（V1×FW×t）
式中：
V——样品总体积（本试验中为 4mL），mL
FW ——样品鲜重（本试验中为 0.5g）
V1 ——测定时样品的用量（本实验为0.02mL），mL
ΔOD470 / t——每分钟吸光度变化值。
（2）也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ U ）表示。
POD总活性（U·g-1 FW）=（ΔOD470×V）/（V1×FW×鄄城盐矿t×0.01）
式中：
V——样品总体积（本试验中为 4mL），mL
FW ——样品鲜重（本试验中为 0.5g）
V1 ——测定时样品的用量（本实验为0.02mL），mL
ΔOD470 / t——每分钟吸光度变化值。
3. 相关标准
GB/T 32131-2015 辣根过氧化物酶活性检测方法 比法
四、 CAT酶活性测定
蒙古天韵
1. 试验原理
植物体内CAT酶的作用是把植物体SOD酶歧化产生的过氧化氢进一步还原为水和氧气，过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化即可测出过氧化氢酶的活性。
4. 实验步骤
取上清液100µl加入比杯中（对照加100µl磷酸缓冲液），加3mL反应液，马上读下240nm下的OD值并计时，每隔1分钟读一次（读0, 1, 2, 3min的OD值）。
反应液的配制：
0.1mol/L pH=7.0的磷酸缓冲液20ml，加0.1mol/L双氧水5ml备用。
0.1mol/L H2O2的配制：用移液移取568µL 30% H2O2 于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。
5. 计算公式
（1）以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔOD240·min-1·g-1 FW表示之。
CAT总活性（ΔOD240·min-1·g-1 FW）=（ΔOD240×V）/（V1×FW×t）
式中
V——样品总体积（本试验中为 4mL），mL
FW ——样品鲜重（本试验中为 0.5g）
V1 ——测定时样品的用量（本实验为0.1mL），mL
ΔOD240 / t——每分钟吸光度变化值。
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