一、目的要求
学习果蔬组织中抗坏血酸过氧化物酶活性的测定原理和方法。
二、基本原理
抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX；AsA-POD）是以抗坏血酸为电子供体的专一性强的过氧化物酶。APX能催化抗坏血酸与H2O2反应而被氧化形成单脱氢抗坏血酸。随着抗坏血酸被氧化，溶液在波长290 nm处的吸光度值下降，根据单位时间内吸光度值的减少，可以计算出APX活性。 三、材料、仪器及试剂
（一）材料
梨、桃、番茄等。
（二）仪器及用具
高速冷冻离心机、紫外分光光度计、研钵、试管、计时器、容量瓶（100 mL、200 mL、1 000 mL）、电子天平。
（三）试剂：中长波辐射器
1．100 mmol/L、pH 7.5磷酸钾（K2HPO4-KH2PO4宏观经济调控
）缓冲液 母液A（1 mol/L K2HPO4）：称取174.18 g磷酸氢二钾，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
母液B（1 mol/L KH2PO4）：称取136.09 g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
取83.4 mL母液A和16.6 mL母液B，混合，调节pH值至7.5，稀释、定容至1 000 mL。
2．提取缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L抗坏血酸和2% PVPP）
称取2.9 mg EDTA，17.6 mg抗坏血酸和2 g PVPP，用100 mmol/L、pH7.5磷酸钾缓冲液溶解、定容至100 mL。4℃预冷保存。油库油气回收处理装置
3．反应缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA和0.5 mmol/L抗坏血酸）
称取2.9 mg EDTA和8.8 mg抗坏血酸，用50 mmol/L、pH7.5磷酸钾缓冲液溶解、定容至100 mL。4℃预冷保存。
4．2 mmol/L H2O2
取1.14 mL 30% H2O2，用蒸馏水稀释至100 mL，混匀，即得200 mmol/L H2O2溶液。再取1.0 mL该溶液，稀释至100 mL，即为2 mmol/L H2O2溶液。
四、实验步骤泰州国税网上申报
（一）酶液制备
称取5.0 g果蔬组织样品置于经预冷的研钵中，加入5.0 mL经4℃预冷的提取缓冲液，冰浴研磨匀浆后，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶粗提液。 （二）活性测定
取1支试管，依次加入2.6 mL反应缓冲液和0.1 mL酶提取液，最后加入0.3 mL 2 mmol/L H2O2启动酶促反应，立即混匀，并开始计时。从启动后15 s开始记录反应体系290 nm的吸光度值，每隔30 s记录一次，连续测定2 min，至少获取6个点的数据。以蒸馏水为参比对分光光度计进行调零。重复三次。
五、实验结果与计算
记录反应体系在波长290 nm处的吸光度值，制作OD290值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD290。然后以每克鲜重（FW）样品每分钟OD290值变化0.01时为一个酶活性单位（U），则U = 0.01△OD290·min-1·g-1 FW。计算公式：
式中：
△OD290——反应混合液在290 nm处吸光度的每分钟变化值；
△t ——酶促反应时间，min；
V ——样品提取液总体积，mL；
Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；
W ——样品重量，g。
六、注意事项
1．在酶反应体系中，抗坏血酸适宜浓度为0.3~0.8 mmol/L，H2O承认论坛2适宜浓度为0.1~0.3 mmol/L。在这里介绍的反应混合液中，抗坏血酸浓度为0.43 mmol/L，H2O2浓度为0.2 mmol/L。
2．一般在室温下测定15~120 s内的吸光度变化值。在实际测定时，应预先测试，以确定适宜的具体反应条件。
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