第36卷 第3期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vol.36No.3 2008年3月Journal of Northwest A&F University(Nat.Sci.Ed.)Mar.2008干旱胁迫对苹果叶片抗坏血酸含量及其代谢 相关酶活性的影响
马玉华1，马锋旺1,2，马小卫1，李明军1，王永红1，韩明玉1，束怀瑞2,1
(1西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100;2山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安271000)含片
[摘 要] 【目的】研究干旱胁迫对苹果叶片抗坏血酸(ASA)含量及其代谢相关酶活性的影响，探讨干旱胁迫与抗坏血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循环的关系，为植物抗旱研究提供理论依据。【方法】以2年生嘎拉苹果(M alus domestica Borkh.)盆栽苗为试验材料，分别在轻度、中度和重度干旱胁迫及复水条件下，检测其叶片相对膜透性、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和ASA2GSH循环各组分(ASA、脱氢抗坏血酸(D HA)、GSH、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、抗坏血酸过氧化物酶(A PX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MD HAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(D HAR)和谷胱甘肽还原酶(GR))含量或活性的变化。【结果】苹果叶片相对膜透性、MDA、H2O2含量随胁迫程度的加剧而上升，复水后下降。
ASA2GSH循环各组分，除ASA含量在轻度干旱胁迫时上升之后略有下降、GSSG含量持续增加外,D HA
和GSH含量,A PX、D HAR、MD HAR和GR活性均在中度胁迫时达最大值，之后下降;ASA/D HA、GSH/GSSG比值均随胁迫程度的加剧而下降，复水后上升。【结论】随着干旱胁迫程度的加剧，苹果叶片ASA2GSH循环系统的防御能力在达到最大防御机能后下降。
[关键词] 干旱胁迫；苹果叶片；抗坏血酸2谷胱甘肽循环
[中图分类号] S661.1;S601[文献标识码] A[文章编号] 167129387(2008)0320150205
E ffects of drought stre ss on ascorbic acid contents and
亚西尔阿拉法特
activities of related metabolic enzyme s in apple leave s
MA Yu2hua1,MA Feng2wang1,2,MA Xiao2wei1,L I Ming2jun1,
WAN G Y ong2hong1,HAN Ming2yu1,S HU Huai2rui2,1
(1College of Horticult ure,N ort hwest A&F Universit y,Yangling,S haanx i712100,China;
2College of Horticult ure Science and Engi neeri ng,S handong A gricult ural Universit y,T ai an,S handong271000,China)
Abstract:【Objective】The st udy was to investigate t he changes in content s ofascorbic acid and activi2 ties of related metabolic enzymes in leaves of apple plant s under t he drought stress conditions and p rimary t heory for t he f ut ure st udy of drought2resistance.【Met hod】The experiment was carried out in t he22year2 old potted apple(M al us domestica Borkh.)plant s to investigate t he changes of relative membrane permea2 bility,MDA content,hydrogen peroxide content(H2O2),t he levels of component s of ascorbate2glutat hione (ASA2GSH)cycle including ASA,dehydroascorbate(D HA),GSH,oxidized glutat hione(GSSG),ascorbate peroxidase(A PX),monodehydroascorbate reductase(MD HA R),dehydroascorbate reductase(D HA R)and glutat hione reductase(GR)under t he light drought st ress,moderate drought stress,severe drought st ress and rewatering conditions respectively.【Result】Relative membrane permeability,MDA and H2O2content s
3[收稿日期] 2007209214
[基金项目] 农业部“948”项目(20062G28)；西北农林科技大学“拔尖人才支持计划”
[作者简介] 马玉华(1979-)，女，河南开封人，在读博士，主要从事果树生理及生物技术研究。
[通讯作者] 马锋旺(1964-)，男，山东汶上人，教授，博士，博士生导师，主要从事果树抗性生理与
生物技术改良研究。
E2mail:fwm64@sina
were gradually increased under t he drought st ress conditions,and decreased after rewatering.The content s of D HA and GSH and t he activities of A PX,D HA R,MD HAR and GR reached t he highest point at t he moderate drought st ress,t hen decreased,except ASA,who se co ntent increased at t he light drought st ress and t hen decreased slightly,and t he GSSG whose content ro se steadily.The ratios of ASA/D HA and GSH/ GSSG decreased under t he dro ught st ress conditions,and increased after rewatering.【Conclusion】The re2 covery ability of ASA2GSH cycle declined obviously after reaching t he maximum wit h t he increasing of drought stress.
宵禁令K ey w ords:drought stress;apple leaf;ASA2GSH cycle
干旱是影响植物正常生长发育的一个重要逆境因子。植物细胞在干旱胁迫条件下产生的大量活性氧(ROS)，能破坏细胞结构[1]。抗坏血酸是一种普遍存在于植物组织的抗氧化物质，在活细胞中，抗坏血酸氧化还原系统由还原型的抗坏血酸(ASA)、氧化型的单脱氢抗坏血酸(MD HA)和脱氢抗坏血酸(D HA)组成[2]。ASA的氧化还原状态反映了植物细胞内外环境的氧化还原状况，当遭遇逆境胁迫时, ASA/D HA比率、相关代谢物和酶类会发生相应的变化[3]。
对小麦[4]、番茄[5]、玉米[6]等的研究表明，盐胁迫、水分胁迫等人为环境胁迫会引起ASA含量、氧化还原状态(ASA/D HA比率)及与其合成和代谢相关的酶活性的变化。Ma等[728]研究表明，光照条件的变化会引起苹果果实抗坏血酸和谷胱甘肽库的水平及抗坏血酸过氧化物酶(A PX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MD HAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(D HA R)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的变化。李明军等[9]研究发现，在苹果叶片离体衰老过程中，伴随H2O2含量、相对膜透性和MDA含量的升高，离体苹果叶片的MD HAR活性下降,A PX、D HAR活性前期升高后期下降,ASA、D HA、总抗坏血酸和总谷胱甘肽(包括氧化型谷胱胱甘肽(GSSG)和谷胱甘肽(GSH))含量随离体培养时间的延长均先上升后下降。
目前，关于高等植物ASA功能和水平调控的生理机制及分子机制的研究，多集中在拟南芥、烟草等少数模式植物上[3]，而对果树等植物在逆境下ASA 代谢机理的研究很少。为此，本试验以2年生嘎拉苹果盆栽苗为材料，研究在干旱胁迫及复水过程中苹果叶片抗坏血酸-谷胱甘肽(ASA2GSH)循环的变化，以探讨干旱胁迫对苹果叶片ASA含量及其代谢相关酶活性的影响，为植物抗旱研究提供理论依据。1 材料与方法
1.1 材 料
试验材料为2年生嘎拉苹果(M al us domestica Borkh.)盆栽苗，砧木为新疆野苹果(M al us siever2 sii(Ledeb.)Roem)。试验苹果苗于2007203中旬植入花盆(30cm×26.5cm×22cm)中，盆中装风干土(V(
园土)∶V(沙)∶V(腐熟羊粪)=5∶1∶1，土壤含水量为141g/kg，土壤饱和持水量为411 g/kg)8.0kg。盆栽苗置于西北农林科技大学园艺场温棚内，常规管理。
试验所用试剂抗坏血酸氧化酶(AO)、D HA、GR、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD H)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP H)等均购自Sigma公司。
1.2 试验设计
干旱胁迫前，供试材料全部浇水至饱和，之后停止供水自然蒸发，每日用取样器在盆中部钻孔取样，深度0～15cm，每盆取样1份，重复3次，用烘干称重法测定土壤含水量。待土壤含水量降至所设置4个处理水平(土壤含水量占土壤饱和持水量的75%～80%(对照)、55%～60%(轻度胁迫)、40%～45%(中度胁迫)、30%～35%(重度胁迫)[10])时，随机采取盆栽苗3～9叶位的叶片，每处理设3次重复。同时采土样测定土壤含水量。采样当日定为0 d，以后隔日采样，干旱处理6d时浇透水，在第8天再取样1次。采后部分叶片投入液氮中，带回实验室进行各项生理指标的测定，以相对电导率和丙二醛(MDA)含量表示干旱胁迫的伤害程度。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 土壤含水量、叶片组织含水量(L RWC)和总可溶性蛋白含量的测定 土壤含水量测定参考文献[11]的方法,L RWC采用烘干称重法[12]测定，总可溶性蛋白含量采用Bradford[13]的方法测定。
1.3.2 相对膜透性、MDA和H2O2含量的测定 相对膜透性和MDA含量的测定均参考文献[12]的
151
第3期马玉华等：干旱胁迫对苹果叶片抗坏血酸含量及其代谢相关酶活性的影响
方法,H 2O 2含量的测定参考林植芳等[14]的方法。1.3.3 ASA 、D HA 、GSH 、GSSG 含量及A PX 、MD HAR 、D HAR 和GR 酶活性测定 以上指标测定均参考Ma 等[728]的方法。
试验中MDA 、H 2O 2、ASA 、D HA 、GSH 和GSSG 含量均为单位干重含量;A PX 、MD HA R 、D HAR 和GR 酶活性均为单位蛋白酶活性。1.4 数据统计与分析
数据统计分析采用DPS 数据处理系统。
2 结果与分析
2.1 干旱胁迫对土壤含水量和苹果叶片组织含水
量的影响
由表1可以看出，在干旱胁迫的0,2,4和6d ，土壤含水量分别达到对照、轻度胁迫、中度胁迫和重度胁
迫所要求的含水量范围，复水后土壤含水量为对照所要求的土壤含水量。L RWC 是衡量植物水合张力的重要指标，在一定程度上反映了植物抗旱性的强弱。从表1可以看出，随土壤干旱程度的增加,L RWC 逐渐降低，各处理与对照相比分别降低
了5.1%,14.3%和26.2%。
表1 干旱胁迫下土壤含水量和苹果叶片组织含水量的变化
Table 1 Changes of soil water content and L RWC
under drought stress
处理时间/d
Treat ment time
土壤含水量/(g ・kg -1)
Soil water content
叶片含水量/(g ・kg -1)
L RWC 0
3227842245
733418364161275228
314
608
2.2 干旱胁迫对苹果叶片相对膜透性、MDA 和
H 2O 2含量的影响
由图1可以看出，随土壤干旱程度的增加，苹果叶片相对膜透性、MDA 含量和H 2O 2含量均显著上升，复水后，三者均有所下降。干旱胁迫2,4,6,8d 时的苹果叶片相对膜透性分别较对照(干旱胁迫0d )增加了4.35%,21.74%,34.78%和8.70%,MDA 含量增加了23.68%,59.18%,87.06%和60.92%,H 2O 2含量增加了18.75%,106%,181%
和53.75%
。
图1 干旱胁迫下苹果叶片相对膜透性、MDA 和H 2O 2含量的变化
Fig.1 Changes of relative membrane permeability ,MDA and H 2O 2contents in apple leaves under drought stress treatment
2.3 干旱胁迫对苹果叶片中ASA 和D HA 含量的影响
由图2可以看出，随土壤干旱程度的加剧，总抗
坏血酸(ASA +D HA )含量在干旱胁迫4d 时达最大值，较对照(干旱胁迫0d )增加了25%，之后其含量开始下降;ASA 含量在干旱胁迫初期(2d )较对照(干旱胁迫0d )略有上升，之后随胁迫程度加剧，含量略
微下降，但变化幅度很小;D HA 含量在干旱胁迫4d 时达到最大值，是对照(干旱胁迫0d )的2.9倍，之后开始下降；反映抗坏血酸氧化还原状态的ASA/D HA 比值在干旱胁迫2,4,6d 时分别较对照(干旱胁迫0d )下降了19%,42%和55.4%，复水后上升，但仍较对照(干旱胁迫0d )下降了
22.7%。
2.4 干旱胁迫对苹果叶片GSH 和GSSG 含量的
影响
谷胱甘肽是植物体内重要的抗氧化剂和氧化还原势调节剂。由图3可知，随土壤干旱程度的加剧，叶片中总谷胱甘肽(GSH +GSSG )、GSH 和GSSG 的含量均有所增加；总谷胱甘肽和GSH 含量在干旱胁迫4d 时达到最大值，分别比对照(干旱胁迫0d )增加了12.5%和4.52%;GSSG 含量在干旱胁迫6d 时达到最大值，较对照(干旱胁迫0d )增加了62.2%；表示谷胱甘肽氧化还原势的GSH/GSSG
比值，随胁迫程度的加剧呈下降趋势，干旱胁迫6d 时较对照(干旱胁迫0d )下降了41.7%，复水后有
2
51西北农林科技大学学报(自然科学版)第36卷
所上升
。
图2 干旱胁迫下苹果叶片ASA +D HA 、ASA 和D HA 含量及ASA/D HA 比值的变化
Fig.2 Changes of total ascorbate ,ASA and D HA contents and ASA/D HA in apple leaves under drought
stress
图3 干旱胁迫下苹果叶片GSH +GSSG 、GSH 和GSSG 含量及GSH/GSSG 比值的变化
知觉现象学Fig.3 Changes of total glutathione ,GSH and GSSG contents and GSH/GSSG in apple leaves under drought stress
2.5 干旱胁迫对苹果叶片ASA 2GSH 循环系统相
关酶活性的影响
如图4所示，在本试验中，苹果叶片于干旱胁迫4d 时,A PX 、D HA R 、MD HAR 及GR 活性均达最
大值，分别比对照(干旱胁迫0d )上升了205%,
97.27%,37.04%和117%，之后随胁迫程度的加剧，其活性均呈下降趋势；复水后各种酶活性均下降，但仍高于对照
。
图4 干旱胁迫下苹果叶片A PX 、D HAR 、MD HAR 和GR 活性的变化
Fig.4 Changes of A PX ,D HAR ,MD HAR and GR activities in apple leaves under drought stress
3 讨 论
ASA 可以直接与单线态氧(O 21
)、超氧自由基
(O 2-・)、过氧化氢(H 2O 2)和羟自由基(HO -)等活性氧(ROS )反应，在ASA 2GSH 循环中,A PX 可以
ASA 为电子供体直接清除H 2O 2，而MD HR 、D HA R 和GSH 有助于保持ASA 的水平，避免对植
物的生长起负面作用的D HA 积累[3]。本试验结果表明，苹果叶片中ASA 含量在轻度干旱胁迫时增加，之后略有下降，而总抗坏血酸和D HA 含量在中
3
51第3期马玉华等：干旱胁迫对苹果叶片抗坏血酸含量及其代谢相关酶活性的影响
度干旱胁迫时增至最大，之后明显降低，使ASA/ D HA比值在整个干旱胁迫过程中持续下降,ASA 的氧化程度加大。随干旱胁迫程度的增加,A PX活性明显上升，在中度干旱胁迫时达最大值,D HA含量与A PX活性同步变化，说明D HA含量与A PX 活性密切相关;D HA R和MD HAR酶活性与A PX 活性变化趋
势相同。说明随干旱胁迫程度的增加, ROS含量增加，激发了苹果叶片中抗坏血酸防御系统，使清除H2O2的A PX和加快ASA循环再生的MD HAR和D HA R酶活性上升，从而缓解了干旱对植物的伤害。这与Pinheiro等[15]报道的咖啡在干旱胁迫下,A PX、GR和D HAR活性升高, MD HAR活性变化不大的结果不同，而与Reddy 等[16]报道的草莓叶片A PX、GR和MD HAR活性在干旱胁迫下显著升高的结果相似，表明这些酶对胁迫的反应因物种而异。复水后，由于水分的恢复和H2O2等ROS的减少，苹果叶片相对膜透性、MDA和H2O2含量、ASA2GSH循环中各组分水平均呈下降趋势，但仍高于对照(GSH除外); ASA/D HA、GSH/GSSG比值上升，但仍低于对照。说明复水可以在一定程度上缓解干旱对植物造成的伤害，这与Sofo等[17]对桃的研究结果一致。
谷胱甘肽是有效的酶活性调节物质，在组织抗氧化能力的维持和对氧化还原敏感的信号传导调节中起着关键作用。还原型谷胱甘肽(GSH)是胞内代谢过程和植物遭受氧化胁迫时产生的过氧化物的有效清除剂之一，机体内的GSSG可以转化为GSH，从而可增强植物对环境胁迫的抵抗。在植物体内,GR通过使胞内谷胱甘肽库保持在还原状态而在氧化胁迫响应中具有重要作用[18]。本试验结果表明，苹果叶片中总谷胱甘肽含量与GSH含量在中度干旱胁迫时增至最大，之后明显降低，而GSSG含量在整个胁迫过程中均明显升高，使GSH/GSSG比值有所下降；但还原GSSG的GR酶活性增加幅度较大。这说明在干旱胁迫下，苹果叶片除了通过GR再生GSH外，还可通过提高自身GSH的合成能力来保持GSH的含量。这与Λircelj 等[19]报道的苹果植株在适度干旱胁迫下,ASA和总谷胱甘肽含量升高，而重度干旱胁迫时ASA和总谷胱甘肽含量下降的研究结果一致。
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