第10卷第4期2012年7月生物加工过程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol．10No．4Jul．2012
doi ：10．3969/j．issn．1672－3678．2012．04．015
收稿日期：2011－05－03
基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2009AA02Z209）；国家自然科学基金资助项目（21106165；21176241）
作者简介：王锋（1979—），男，江苏镇江人，博士，助理研究员，研究方向：微生物发酵；刘春朝（联系人），研究员，
E-mail ：czliu@home．ipe．ac．cn 漆酶及其应用 王
锋1，刘
英1
张震寰
，汪
印2，许光文2，刘春朝
1
（1．中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190；
2．中国科学院过程工程研究所多相复杂系统国家重点实验室，北京100190）
摘要：结合当今该领域的最新研究进展，综述了漆酶来源、结构、作用机制、介体系统及其在水相和非水相中的应 用，
以期为漆酶催化性能的进一步研究提供一定的借鉴和参考。关键词：漆酶；催化；废水处理；水相体系；非水相机体系中图分类号：Q814．2 文献标志码：A
文章编号：1672－3678（2012）04－0070－07
田间持水量
Laccase and its applications
WANG Feng 1，LIU Ying 1，WANG Yin 2，XU Guangwen 2，LIU Chunzhao 1
（1．National Key Laboratory of Biochemical Engineering ，Institute of Process Engineering ，Chinese Academy of Sciences ，Beijing 100190，China ；2．National Key Laboratory of Multiphase Complex System ，Institute of Process Engineering ，
Chinese Academy of Sciences ，Beijing 100190，China ）
Abstract ：Laccases are multicopper oxidases．It has received the widespread attention because of non-specific oxidation ability．On the basis of the latest research in this field ，the paper summarized source of laccase ，structure ，mechanism of action ，mediator and its application in aqueous system and non-aqueous system so as to provide a reference for further improvement of the laccase catalysis．Key words ：laccase ；catalysis ；wastewater treatment ；aqueous system ；non-aqueous system 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗 坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属于蓝
多铜氧化酶的家族［1］
。漆酶一般含有4个铜原子，分布于3个不同的高度保守的结合位点，每个铜
原子在催化机制中都能发挥很重要的作用。漆酶能催化氧气，通过4个电子还原成水，同时伴随着一些酚类底物的氧化。漆酶的作用底物相当广泛，对芳香胺、硫酚、聚甲氧基苯、双酚、苯硫醇和酚类染料等都显示出较强的催化能力。因此，漆酶作为一种绿催化剂在水相和非水相体系中的应用日益受到关注。
1漆酶的来源
漆酶最早是由日本的Yoshida 于1883年在漆
树的分泌物中发现的［2］
，随后Bertrand 和Laborde
于1896年又证实在一些真菌中也含有这种酶［3－4］
。目前，按照漆酶的来源可将漆酶分为植物漆酶
（plant laccase ）和真菌漆酶（fungal laccase ）两大类
［5］
。
植物漆酶主要分布在漆树科植物中［6］
，其中Rhus vernicifera 主要生长在中国和日本，Rhus succe-danea 主要生长在越南和柬埔寨，Rhus toxicodendron
分布在美国。在真菌中，漆酶广泛存在于担子菌纲的多孔菌（Polyporus ）、子囊菌纲的柄孢壳菌（Podos-pora ）和脉孢菌（Neuros pora ）及半知菌类的曲霉菌（Aspergillus ）等菌种中［7－8］。
漆酶除了来源于植物和真菌外，也存在于细菌中［9］
。
2
漆酶的结构和催化机制
2．1
漆酶的结构
漆酶是一种铜蛋白，
一般含4个Cu 2+
，根据光谱和磁性特征可将漆酶中的铜离子分为3类（图
1）［10］：Ⅰ型Cu 2+和Ⅱ型Cu 2+各1个，是单电子受
体，
呈顺磁性，可用电子顺磁共振（EPR ）测定；Ⅲ型Cu 2+2个，是双电子受体，呈反磁性，
EPR 检测不出。Ⅰ型Cu 2+
眼中体
具有典型的蓝铜谱带，紫外可见光谱上600nm 处出现峰值，在核电EPR 可见区显示4条电
子转移条带，其中由Cys →CuI 产生的条带最强，是
漆酶产生蓝的主要原因；Ⅱ型Cu 2+
非蓝，呈松散的扭曲四面体结构，只具有一般的EPR 谱带，没
有特征吸收光谱；Ⅲ型Cu 2+
是耦合的离子对，具有抗磁性，在330nm 处有宽的吸收带。根据X 线、光
谱、磁性和实验事实推测，Cu 2+的配位结构为：Ⅰ型Cu 2+分别被与Cys 、Phe 的2个S ，2个His 中的N 配
位，形成变形的四面体；Ⅱ型Cu 2+
是三核簇，分别与2个His 中的N 和1个O 配位，氧化型的漆酶含氧
配体可能是H 2O 或OH —；Ⅲ型Cu 2+的2个Cu 2+
分别与3个His 中的N 配位，又同时与Tyr 中的O 配位形成氧桥组成双核铜区
。
图1
含4个铜原子漆酶的催化结构域类型
［11］
Fig．1
Model of the catalytic cluster of the laccase made of four copper
任丘四中
atoms
图2
典型真菌漆酶的三维结构示意
Fig．2
The three-dimensional structure of typical fungal laccase
随着晶体衍射技术的不断进步和发展，漆酶
的三维结构被逐步解析出来。1998年，Ducros 首先对从灰盖鬼伞（Corpprinus cinereus ）中提取的漆
酶（CcL ）进行了结晶，并分析了同一晶体2．2 分
辨率条件下的X 单晶衍射图谱（图2）
［12］
。结果表明，单个酶分子由3个杯状结构域组成，三者紧密
连接在一起，形成球状结构。近些年来，又有一些
真菌漆酶被结晶并解析了其晶体结构（图2），
如变栓菌［13－14］
和热白丝菌（Melanocarpus albomy-ces ）［15］等，这些漆酶都是含有全部铜原子的活性漆酶结构。热白丝菌漆酶（MaL ）分子为一个近似
球形的单体蛋白，由3个桶状结构域（A 、B 和C ）组成，这3个结构域分别含157、
154和218个氨基酸残基。该酶蛋白高度糖基化，其分子中存在有
1
7第4期王锋等：漆酶及其应用
糖链，3对二硫键则分别位于结构域A 的Cys 4与Cys 12、结构域A 和C 的Cys 114与Cys 540、结构域B 的Cys 298与Cys 332之间，这种结构能够保
持酶分子的稳定［15］
。对变栓菌漆酶（TvL ）1．9 分辨率条件下晶体结构的研究表明，
TvL 也是一个近似球形的分子，由3个桶状结构域（D1、D2和D3）构成，分子中也有二硫键、
loop 和糖链［14］。此外，
Enguita 分析了一个来自细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）的“漆酶样”活性蛋白（Endospore coat protein CotA ）的晶体结构，其结构也近似球形分子，由3个桶状结构域组成，其结构如图2
所示［16］
。
图3漆酶的催化循环
［18］
Fig．3
Catalytic cycle of laccase
2．2漆酶的催化反应机制
漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型的底物进行氧化反应的机制是通过一种产生自由基的单电子反应，主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4个铜离子的协同作用。漆酶催化底物氧
化反应是通过以下3个主要步骤：1）Ⅰ型Cu 2+
从还原型底物接受电子被还原；2）电子被传递到Ⅱ型Cu 2+和Ⅲ型Cu 2+形成T2/T3结构域的三核中心；3）分子氧被激活并在T2/T3三核结构域被还原成水［6，17］
。然而，漆酶自然态中间体也可缓慢地转变成完全氧化的“休眠”漆酶，这种“休眠”漆酶具有从
三核结构域中分离出来的游离Ⅱ型Cu 2+
（图3）。自然态中间体只有在还原剂缺乏的情况下才会发
生向休眠态的转变，休眠态的Ⅰ型Cu 2+
位点能够被
底物还原，
而其三核结构域上的电子传递速率很慢以至于对整个催化过程的贡献不显著［6］
fm2009下载
。漆酶能够催化氧化多种酚类化合物，在此过程中，漆酶结合酚类底物的电子能产生自由基并伴随着分子氧被还原成水。2．3
漆酶介体系统
当底物的氧化还原电势比漆酶高或者底物太大以致于无法接近漆酶的催化位点时，一种被称为漆酶介体系统（laccase-mediator system ，LMS ）的反应体系可以用来完成此类反应，具体过程如图4（b ）所示。介体首先与漆酶反应形成具有反应活性的被氧化的中间体，这个被氧化的中间体再去氧化形成目标底物。常用的合成介体主要包括2，2'-连氮
基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐
（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzylthiozoline-6-sulphate ），ABTS ）、N -羟基苯并三唑（N -hydroxybenzotriazole ，HBT ）、3-羟基-2-氨基苯甲酸（3-hydroxyanthanilic acid ，HAA ）、紫脲酸（violuric acid ，VA ）、N -羟基邻苯
二甲酰亚胺（N -hydoxy-phthalimide ，HPI ），2，2，6，6-四甲基氧化物（2，
2，6，6-tetramethyl-1-piper-idinyloxyl ，TEMPO ），各分子结构如图5所示。除了这些化合物以外，盐酸异丙嗪（PTC ）、吩噻嗪（PT ）及2-亚硝基-1-萘酚-4-磺酸（HNNS ）也能用作漆酶介体。因这些人工合成的介体性质不稳定，价格昂贵及本身或者衍生物具有毒性，一些真菌次生代谢产物或者木素降解产物被开发出来作为天然介体，如丁香酸甲酯（MS ）和紫丁香醛。
近年来，因多金属氧酸盐（polyoxometalates ，POM ）具有多功能催化活性而受到越来越多的关注。POM 既具有金属氧化物和配合物的结构特征，又有氧化还原和强酸性，且结构确定、再生速率快，在脱木素中显示出良好的氧化还原催化性
能。因此，
POM 作漆酶介体是完全可行的。Kim 等
［19］
研究发现，
POM 作漆酶介体能够有效地促进纤维漂白。介体/底物的作用机制由于介体结构的不同而有所差异，主要包括电子传递（electron transfer ，ET ）、氢原子传递（hydrogen-atom transfer ，HAT ）或离子氧化（ionic oxidation ）
［20］
。带有N —OH 基团的介体（HBT ，
科学家发现迄今最小恐龙VA ，HAA ，HPI ）主要通过氢原子传递途径；介体ABTS 采用电子传递途径；TEMPO 及其类似物采用离子氧化途径。
2
7生物加工过程
第10卷
图4没有介体和存在介体条件下的漆酶催化底物氧化循环示意图［11］
Fig．4Schematic representation of laccase-catalyzed redox cycles for substrates oxidation with or without chemical mediators
图5漆酶介体的化学结构［18］
Fig．5Chemical structures of laccase madiators
3漆酶的应用
3．1漆酶在水相体系中的应用
漆酶在水相体系中主要被用于废水处理。工业废水中纺织业的染料废水和造纸业的漂白废水含有度高、难生物降解的有机物，用常规的物理和化学处理手段很难保证废水的达标排放，因此这两类废水已经成为水环境的重要污染源。染料废水中含有大量芳香环染料，造纸工业的漂白废水中含有大量的氯化有机物，如氯苯酚、氯化脂肪酸、氯化树脂酸、二恶英等。这些有机物对环境中的生物具有强烈的毒害、致畸、致多发性脑神经病变作用。漆酶能够有效地进行染料脱及降解酚类化合物，因此被越来越多地应用于废水处理［21－24］。
根据染料结构的不同，可将染料分为蒽醌染料、偶氮染料、靛蓝类染料和三芳基甲烷染料等。恩醌类染料是漆酶的底物，一般可被漆酶直接氧化，但有时也须借助介体才能完成脱［25－28］。对偶氮染料而言，漆酶借助自由基反应形成酚类化合物，无须直接破坏偶氮键，因此避免了形成有毒的芳香胺，更有利于控制环境污染［27］。但大多数偶氮染料并非漆酶的直接底物，借助小分子介体，即漆酶/介体系统进一步拓宽了可降解转化偶氮染料的种类，提高了脱效率［30－31］。靛蓝类染料是芳香族的还原性染料，因其具有稳定的共轭结构，生物降解性很差，利用漆酶/介体系统也可以有效地完成脱反应［32－33］。部分三芳基甲烷染料可以在漆酶单独作用下进行脱，但往往需要较长的时间，加入介体后可明显提高脱速率［34］。冯晓静［35］研究了漆酶对造纸业的漂白废水中木素的催化聚合作用，发现经过漆酶处理后，废水中木素的相对分子质量明显变大，1h后沉池出水中木素的相对分子质量由3.12ˑ104变为4.66ˑ104；处理2h后的木素相对分子质量为5.86ˑ104。刘明友等［36］在SBR 反应器中投加固定化漆酶共同处理制浆中段废水，废水的COD、BOD去除率以及度的下降率都明显
37
第4期王锋等：漆酶及其应用
地升高。COD去除率达到90%以上，出水COD在120mg/L以下；BOD去除率达到95%左右；出水度下降到50倍以下，符合最新国家废水排放标准。
漆酶在水相中的应用除了用于废水处理，还可以用于化学合成。Chung等［37］在水相的反应体系下，用漆酶催化明胶和儿茶素制得具有抗氧化作用的明胶-儿茶素结合体。此外，漆酶还可以在水相缓冲液中催化L-萘酚［38］、丙烯酰胺［39］、丁香酸［40］生成相应的聚合物。
3．2漆酶在非水相中的应用
漆酶的许多重要底物水溶性较差，需要添加有机溶剂或者其他介质进行助溶，因此在非水相体系中漆酶的应用也引起了广泛的关注［41－42］。Tanaka 等［43］以来自Traetes sp．的漆酶作催化剂催化氧化苯酚时发现，在水相的缓冲液体系中没有聚合物生成，在水和丙酮的混合体系中能生成不溶于N，N-二甲基甲酰胺和甲醇的高相对分子质量聚合物。当丙酮体积分数为20% 30%时，产物得率最大。当底物为甲氧基苯酚时，在反应体系中加入10% 30%丙酮，m-甲氧基苯酚的得率和聚合速率都得以提高。丙酮体积分数为20%时，p-甲氧基苯酚氧化速率最大。Rodakiewicz-Nowakd等［44］研究了与水互溶的有机溶剂乙腈、丙酮和二甲基亚砜对几种真菌漆酶活性的影响。研究表明，乙腈、丙酮和二甲基亚砜这3种溶剂对漆酶均有抑制作用，抑制程度主要取决于溶剂的疏水性。Rodakiewicz-Nowakd等［45］还研究了白腐菌漆酶CUL在3mol/L的乙醇、丙酮和二甲基亚砜溶液中的稳定性及其催化丁香醛联氮的能力。结果表明，与来自P．radiata相比，漆酶CUL在丙酮中更敏感，而在二甲基亚砜中则更为有效；在乙醇中，漆酶CUL不如来自P．tigrinus的漆酶敏感。Shiba等［46］以漆树和血红密孔菌为来源的漆酶作为催化剂，在丙酮与水的混合溶液中进行了异丁子香酚和松柏醇的催化反
应，发现真菌漆酶的催化氧化速率是漆树漆酶的3 7倍；结果还表明，催化速率是由底物和漆酶本身的特性所共同决定的。Ikeda等［47］以丙酮、甲醇、1，4-二氧六环为混合溶剂，用Pycnoporus coccineous漆酶氧化聚合2，6-二甲苯酚。张金梅等［48］的研究表明，以苯二胺作底物，漆树漆酶在醇溶剂中的催化能力要强于在二氧六环和四氢呋喃中；醇分子中羟基个数对漆酶性能有很大的影响，随着羟基数量的增加，酶活明显提高；当丙三醇与水体积比为1ʒ1时，酶活力最高，是在纯水中的1.5倍。在pH为7.5、体积比为1ʒ1的丙三醇-水混合溶液中，漆树漆酶可催化氧化对茴香胺反应。反应产物经光谱鉴定主要为对偶氮茴香醚。Silvia等［49］以T．Pubescens漆酶作催化剂，在缓冲溶液与醋酸乙酯的混合体系中，以及以Myceliophtora 漆酶作催化剂在体积比为1ʒ3的二氧六环与缓冲溶液饱和的甲苯混和体系中，进行17β-雌二醇的催化氧化。结果表明，所用的漆酶在实验的混合体系中都可将17β-雌二醇氧化为氧游离基，继而偶合生成C—O或C—C的二聚物，再进一步氧化成为寡聚物或聚合物。Ma等［50］研究了异辛烷、正己烷、甲苯、二氯甲烷、氯仿等有机溶剂对来自Rhus vernificera 的漆酶催化天然酚类物质氧化反应的影响。研究结果表明，在正己烷中，当缓冲溶液含量为6.5%时，漆酶活性达到最大；用于实验的有机溶剂logP 为2.5 4.5时，漆酶对（+）焦儿茶酚和（－）表儿茶素的催化氧化能力提高；儿茶酚的酶促氧化反应不同于在水相中的反应，不发生聚合反应，而生成具有很高的医疗应用价值的中间产物DOPA-醌。Musta-fa等［51］用Myceliophthora thermophila漆酶作催化剂，研究了水相及水-乙酸乙酯两相体系中阿魏酸的氧化反应。结果显示，在水-乙酸乙酯两相体系中，可生成较为稳定的酚型素中间产物，此产物只存在于有机相中，在常温光
照条件下能稳定45d以上。在水相体系中，这种产物非常很少。这是由于在水相中漆酶及生成的醌类自由基都有很高的活性，中间产物聚合很快。在水-有机两相体系中，由于漆酶活性下降且中间产物又转入了有机相，阻止了聚合反应的发生，因而能获得理想的目标产物。
总之，漆酶在非水相体系中的催化反应，除了反应速率、转化率等与普通水相中不同外，往往产物也有所不同，这就可能实现某些特定的化学反应，通过有机溶剂的选择调控不同的产物。
4展望
漆酶作为一种环境友好的绿催化剂，因其催化反应条件温和、无毒副产物产生而日益引起关注。在介体分子的协助下，漆酶的底物范围大大拓宽，其催化反应速率和转化率也得以大幅提高。但目前，高质量的工业化漆酶来源较少导致漆酶价格过高等因素制约着漆酶的产业化应用。为加速漆酶的工业化应用进程，应结合基因工程技术、微生物和酶技术，特别是近二十年来非水酶学和有机相
47生物加工过程
第10卷
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