DNAzyme核酶简介

我是核酸，也是酶——DNAzyme核酶简介

1982年，美国科学家T. Cech在研究中发现了核酶（ribozyme），自身剪接内含子的RNA具有催化功能[1]。这揭示了酶不仅有蛋白一种组成形式，也有可能是核酸。无独有偶，Gerald Joyce在1994年发现了脱氧核酶（DNAzyme），可以催化单个核糖核苷酸磷酸酯的Pb2+依赖性切割[2]。迄今为止已经发现了数十种DNAzyme。

DNAzyme一般是通过SELEX体外筛选技术获得。下面以RNA切割活性的DNAzyme为例，简单介绍体外筛选的过程。如图1所示，用于筛选的DNA文库包含一段60个随机碱基的部分（图中绿部分），两侧是能与PCR产物结合的序列（黑部分），PCR产物结合序列的上游包含RNA位点，作为DNAzyme的底物。在文库DNA的5’端修饰有生物素，与链酶亲和素结合从而固定在固相表面。金属离子存在时，小部分文库DNA序列可以折叠形成带有酶活性的结构，切割RNA位点，这部分文库得以从固相表面释放下来。切割下来的产物通过两轮PCR进行富集，第一轮PCR扩增全长序列，第二类PCR通过引物再次引入RNA位点和生物素标签。通过5~10轮的重复直到文库达到饱和。接下来对文库测序以鉴定出那些活性最高的序列[3]。重庆师范大学初等教育学院

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图1：RNA切割活性的DNAzyme体外筛选获得的方法

核酶的种类

根据催化功能的不同，可以将DNAzyme分为5大类：RNA切割活性的DNAzyme、DNA切割活性的DNAzyme，具有连接酶功能的DNAzyme，过氧化物酶活力的DNAzyme，修饰胸腺嘧啶二聚体的DNAzyme[4]。下面分别介绍这五类DNAzyme。

1. RNA切割活性的DNAzyme

这类DNAzyme是发现最早，也是研究的最深入的一类DNAzyme。比较早被研究的是8-17

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和10-23两种DNAzyme，它是在1997年由SELEX（指数富集的配基系统进化技术）发现的，命名来源于体外筛选的过程，8-17是筛选过程的第8轮的第17个克隆获得，而10-23是筛选过程的第10轮的第23个克隆获得[5]。

图2：8-17和10-23两种DNAzyme的结构

如图2所示，为8-17和10-23两种DNAzyme的结构。其中反义链为DNAzyme链，正义链为DNAzyme的底物链，两者通过碱基互补配对形成部分双链的结构。DNAzyme在未配对的位置形成一个环状结构，是其进行催化反应的中心。DNAzyme催化箭头所示位置核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂，形成3’端带有2’，3’-环磷酸结构和5’端带有羟基的两条核苷酸链[3]（图3）。

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图3：RNA切割活性的DNAzyme的切除产物梁茂春

2. DNA切割酶活性的DNAzyme

脱氧核酶不仅仅对RNA有活性，在一定的条件下也可以完成DNA的切割。在铜（II）离子和抗坏血酸钠（SA，Sodium ascorbate）存在的条件下，Cu- DNAzyme可以对图4箭头所

示位置的G碱基位置的磷酸二酯键发生断裂，而二价的铜（II）离子也被还原成一价的铜（I）离子。如果体系中存在组氨酸，则铜（II）离子会与组氨酸形成配合物，无法发生DNA切割反应[6]。

图4：Cu- DNAzyme 的断裂原理

3.连接酶活性的DNAzyme

Cuenoud等[7]筛选到了一个47 nt具有DNA连接酶活性的DNAzyme，命名为E47。图4所示的实验首先利用有RNA切割活性的DNAzyme将O1链切断，得到O2链，接下来在E47的催化作用下，O2与另一条DNA链O3完成链接，得到O4链。这里之所以不能使用O1经过RNA切割活性的DNAzyme剪切得到的另一条核酸链，是因为另外一条核酸链的3’ 端经过剪切后得到的是2’，3’-环磷酸结构，E47无法进行催化。此外，用于连接的O3需要使用咪唑和EDC 将3’ 端的磷酸进行活化，E47所催化的是5’ 端羟基与3’ 端的磷酸（咪唑活化）之间的连接。

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图5：DNA连接酶活性的DNAzyme E47的连接过程

也有DNAzyme催化RNA的3’-5’连接过程。镁离子依赖的9DB1和锌离子依赖的7DE5都可以催化这一反应，底物RNA链的5’端需要进行三磷酸化，这种三磷酸化的RNA链可以通过使用T7 RNA polymerase进行体外转录得到[8]。

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