⼿把⼿教你筛选与转录因⼦TF结合的共调控因⼦，为你的lncRNA研究思路锦上 添花
近⼏年长链⾮编码RNA（lncRNA）作为国⾃然申请⽅向中的⼀个⽕热的研究热点，通过各种数据库，芯⽚，⼆代测序等等等，好不容易在⾃⼰研究的肿瘤⾥到了⼀个⼼仪的lncRNA，验证了⼀系列的表型或功能。那么接下来机制研究怎么搞呢？或许⼤多数⼈研究的⽅向为其下游，⽐如⽤ChIRP-seq实验寻与lncRNA相互作⽤的DNA，或者⽤ChIRP-MS、体外转录RNA pulldown⽅法去寻与lncRNA作⽤紧密的转录因⼦蛋⽩等等。其实如题，既然你的lncRNA功能这么强⼤，我们还可以上游，到调控它的TF和co-factors。下⾯就根据⼏种不同的预测数据及实验验证思路对我们的⽂章锦上添花。 1、⾸先，准备数据库。
需要⽤到⼏个数据库，如NCBI、UCSC启动⼦；PROMO预测TF；The human protein atlas蛋⽩定位；基于TCGA数据库的GEPIA⽬的基因⽣存分析及表达相关性。
2、得到基因的promotor序列：
拿驱动蛋⽩KTN1 DNA为例。⾸先，我们在UCSC genomebrowser中输⼊KTN1，
点击你看的顺眼的那条KTN1的转录本（具体怎样选转录本在Uniprot上查“canonical）”，可以看到KTN1的概述，点击GenomicSequence，
只在Promoter/Upstream位置打勾，注意Downstream不要打勾，我就吃过亏，它指的不是转录起始位点TSS的下游，⽽是全基因的下游！！
点击submit，返回得到KTN1的启动⼦序列。
3、预测转录因⼦：普利斯特里
3g终端
可以看到，KTN1 promotor的转录因⼦预测有18个。分别点击进去，可以了解预测的结合位点等等信息。下⾯就可以进⾏验证了，⽤IDT⽹站或者Primer 6.0软件等进⾏这18个基因的引物设计，在你收取的肿瘤组织中分别做验证，是否正调控（⼀般转录因⼦都是positive的），砍掉⼏个没⽤的，留下有⽤的，再分别设计siRNA在细胞系中进⾏敲低，留下对KTN1影响最明显的那个。OK，TF选择搞定。
4、ChIP实验验证是否结合：
上⾯假设我们最后选择了XBP-1这个TF，可以看到，XBP-1与KTN1的预测结合位点在AGTCAT，那么ChIP实验被应⽤，设计包含AGTCAT序列的KTN1引物，买个ChIP kit检测，很漂亮，确实有变化。之后就是通过luciferase或者EMSA套路的⽅法检验⼆者是否在这个结合位点结合，验证完毕。
过氧乙酸
5、与TF相互作⽤的共调控因⼦的筛选：
继续以XBP-1为例。⾸先，我们⽤XBP-1抗体做⼀个CO-IP实验，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染⾊或者银染，银染敏感性更⾼⼀些。切胶送去打质谱。⼀般切胶回收的质谱都只能定性不能定量。从质谱的结果中减掉IgG背景值后筛选Fold change⼤于2.0以上的差异蛋⽩。 下⾯我们来筛选最可能作⽤的co-factor，⾸先在GEPIA数据库中输⼊已经筛出来的差异蛋⽩名称，检测与XBP-1的相关性，以FOXP1为例，选择Correlation输⼊Gene A为XBP-1，Gene B为FOXP1，选择你研究的肿瘤，点击Plot，看，相关性数据出来了。⼀般我们选取R值⼤于30%相关系数的蛋⽩。莺啼山客犹眠
接下来，打开 The human protein altas 数据库，搜索 FOXP1 及其他 CO-IP 出来的蛋⽩，可以发现 FOXP1 主要定位于细胞核内， so ，结合与 XBP-1 的相关性分析，排除掉单纯位于细胞质内或细胞膜的蛋⽩，细胞核内的蛋⽩作⽤可能性最⼤。归化城
6、最后，CO-IP-WB验证：隧道烘箱验证方案
按上述⽅法筛选出⼩范围的⼏个蛋⽩进⾏WB验证，正确位置即显⽰条带。最后，附上此co-factor肽段图谱，加⼊到lncRNA机制研究中，完美5分以上⽂章。
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