崔菊;陈爱;庞婧;李瑾;李云炫;张铁梅;蔡剑平
【摘 要】目的 比较高脂喂饲小鼠影响体内能量代谢的性别差异,探讨其可能机制. 方法 C57BL/6小鼠分为4组,雌、雄鼠各两组,每组各10只.其中一组雄鼠和一组雌鼠喂饲正常饲料,另外一组雄鼠和一组雌鼠喂饲60％高脂饲料12周.观察各组小鼠的体质量、血清生化水平、24h内能量消耗的改变;采用Western blot检测小鼠棕脂肪组织中解偶联蛋白1(UCP1)和马达蛋白KIF5B的表达水平. 结果 与雌鼠比较,高脂喂饲条件下,雄鼠的体质量增长(P＜0.05);葡萄糖耐受水平降低(P＜0.05);空腹血糖、血清胰岛素、瘦素和肿瘤坏死因子-α水平均显著上升(P＜0.05);血清甘油三酯、总胆固醇和脂联素水平无统计学差异(P＞0.05);能量消耗显著下降(P＜0.05),呼吸熵和活动能力没有统计学差异(P＞0.05);棕脂肪组织中UCP1和KIF5B的表达下降. 结论 雄性小鼠在高热量饮食下更容易肥胖,雌鼠棕脂肪组织通过较强的产热功能,消耗多余能量,维持机体能量代谢平衡.%Objective To compare the difference of energy metabolism between male and female mice,and to explore the possible mechanism of gender difference in metabolic disorders.Methods The C57BL/6 mice were divided into 4 gr oups(n =10 each):two groups of male mice and two groups of female mice.The mice in one male group and one female group were fed with standard chow diet,and the mice in the other groups were fed with 60％ high fat diet for 12 weeks.The body weight,serum biochemical levels and 24 h energy consumption in the mice were observed.Western blot was used to detect the expression of KIF5B and UCP1 in brown adipose tissues.Results After fed with high fat diet,the body weight gain was significantly higher in the male mice than that of female mice (P ＜ 0.05),and the levels of fating blood glucose,serum insulin,leptin,and TNF-α were also significantly higher(P ＜ 0.05),while the glucose tolerance level was lower(P ＜ 0.05).There was no statistical difference in the levels of serum triglyceride,total cholesterol and adiponectin between male and female mice after fed with high fat diet(P ＞ 0.05).The energy expenditure was significantly lower in the male mice compared with the female mice after fed with high fat diet(P ＜ 0.05).There was no statistical difference in the respiratory quotient and ambulatory activities between the male mice and female mice after fed with high fat diet(P ＞ 0.05).Western blot results revealed that the expression levels of KIF5B and UCP1 in brown adipose were higher in
male mice than that in female mice after fed with high fat diet.Conclusion Compared with female mice,male mice have a higher susceptibility to obese on the condition of high fat diet.The brown adipose of the female mice have stronger thermogenice function which can help the body to consume excess energy and maintain energy metabolic balance.魔爽烟
【期刊名称】《山西医科大学学报》
【年(卷),期】2017(048)007
【总页数】聚氨酯改性环氧树脂7页(P658-664)
【关键词】高脂饮食;能量代谢;性别差异;马达蛋白
【作 者】崔菊;陈爱;庞婧;李瑾;李云炫;张铁梅;蔡剑平
【作者单位】北京医院,国家老年医学中心,卫生部北京老年医学研究所,卫生部老年医学重点实验室,北京100730;北京医院,国家老年医学中心,卫生部北京老年医学研究所,卫生部老年医学重点实验室,北京100730;北京医院,国家老年医学中心,卫生部北京老年医学研究所,
卫生部老年医学重点实验室,北京100730;北京医院,国家老年医学中心,卫生部北京老年医学研究所,卫生部老年医学重点实验室,北京100730;北京医院,国家老年医学中心,卫生部北京老年医学研究所,卫生部老年医学重点实验室,北京100730;北京医院,国家老年医学中心,卫生部北京老年医学研究所,卫生部老年医学重点实验室,北京100730;北京医院,国家老年医学中心,卫生部北京老年医学研究所,卫生部老年医学重点实验室,北京100730
【正文语种】中 文
【中图分类】R589.2
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随着人们生活方式的改变和人口老龄化,肥胖和2型糖尿病已经成为危害人类健康和生活质量的主要疾病,而肥胖等代谢性疾病存在显著的性别差异[1]。虽然社会和文化环境等因素被认为构成男女之间的肥胖差异,但是生物差异的影响更加重要[2]。对性别差异的更广泛了解将为基于证据的具体干预提供基础[3]。
迄今为止,已有许多研究探讨了与肥胖有关的性别差异因素,包括体脂分布[4]、活动量[3]、代谢率[5]、性激素[6]、脂肪因子信号通路[7]和食欲调节[8]。然而在对肥胖的易感性因素中,
性别所起的作用尚未完全了解。一些研究表明,雄性较雌性动物更容易肥胖[9]。然而与之相反的研究结果也有报道,这可以通过种属和性别之间的差异以及动物营养状态的差异来解释[10]。已有研究表明,能量代谢存在性别二态性,特别是在白组织棕化及棕组织产热能力存在显著的差异[11,12]。
近年来,在基础与临床研究中发现,马达蛋白介导的胞内运输失调可能直接影响细胞功能和疾病的病理生理过程。KIF5B是人体各个组织中普遍表达的驱动蛋白重链(ubiquitous kinesin heavy chain, uKHC)的同源基因。本课题组前期研究结果发现,脂肪组织中特异性敲除Kif5b加重了高脂诱导的肥胖程度,KIF5B通过调节脂肪因子分泌、胰岛素信号通路、线粒体生成和功能从而在糖代谢、脂代谢和能量代谢中发挥重要作用[13],是一种潜在的代谢疾病的新药靶。
本研究旨在比较高脂喂饲对雌、雄小鼠体内能量代谢以及棕脂肪组织中UCP1和KIF5B的蛋白表达水平的影响差异,探讨导致代谢紊乱性疾病的性别差异的可能机制。
1.1 小鼠及饲养
8周龄SPF级C57BL/6雌、雄小鼠各20只购自北京维通利华公司。C57BL/6小鼠饲养于具有恒定环境温度的12 h光/暗循环房间中。实验小鼠分为4组,雌、雄鼠各两组,每组10只,其中一组雄鼠和一组雌鼠喂饲正常饲料,另外一组雄鼠和雌鼠喂饲高脂饲料12周。每周对小鼠体重进行称量。所有动物护理和实验方案由国家老年医学中心和北京老年医学研究所的机构动物护理和使用委员会批准。
1.2 小鼠饲料和主要试剂
小鼠饲养正常饲料(12.8%脂肪,21.6%蛋白质,65.6%碳水化合物)和高脂饲料(60%脂肪,20%蛋白质和20%碳水化合物)购自北京华阜康公司;血糖试纸购自Johnson公司;血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)试剂盒购于南京建成生物工程研究所;检测血清胰岛素(insulin)、脂联素(Acrp)、瘦素(Acrp)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的ELISA剂盒分别购于ALPCO公司、Millipore公司和Raybiotech公司;兔源KIF5B抗体由香港大学黄建东教授提供;兔源β-Actin抗体购自康为世纪公司。
1.3 葡萄糖耐量试验
小鼠禁食16 h,自由饮水,腹膜内注射浓度为2 mg/g体重的葡萄糖。葡萄糖注射之前30 min和注射后15,30,60和120 min,葡萄糖试纸监测血糖水平。
钢筋混凝土1.4 血清指标检测
小鼠禁食禁水12 h,按照0.1 ml/10 g的剂量腹腔注射5%水合氯醛进行麻醉。小鼠麻醉后,切开胸壁用注射针刺入心脏取血。全血放入促凝管中常规分离血清,储存于-80 ℃冰箱备用。血清甘油三酯、总胆固醇、胰岛素、脂联素、瘦素和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平通过市售试剂盒检测,实验严格按照产品说明书操作。
1.5 代谢笼实验
通过代谢笼实验检测高脂饮食对小鼠体内代谢的影响。将5月龄小鼠单独饲养在代谢笼(OxyletPro呼吸能量饮食饮水代谢检测系统,西班牙Panlab公司)中,自由获得饮食和水。适应24 h,检测每个笼子的代谢参数(包括能量消耗、呼吸熵)。通过活性传感器检测小鼠的动态活动。使用SMART3.0软件(代谢v2.2)自动记录和计算所有数据。
1.6 Western blot检测棕脂肪组织中UCP1和KIF5B的表达情况
颈椎脱臼处死小鼠,采用75%乙醇擦拭颈部皮肤,切开颈部皮肤,快速剪切棕脂肪组织。棕脂肪组织经预冷的PBS漂洗后储存于-80 ℃冰箱备用。在液氮中将冷冻的组织研磨成粉末,然后将粉末转移到冰上预冷的Eppendorf管中,按1 ∶10加入组织裂解液(10 mmol/L Tris-Cl (pH7.4),0.15 mol/L NaCl,1% NP40,0.5% sodium deoxydulok,1 mmol/L EDTA,0.1% SDS,0.01% sodium azides,1% Triton X-100)混匀,置于4 ℃裂解30 min,样品在4 ℃以12 000 r/min离心15 min,取清液,利用BCA法定量蛋白浓度。50 μg蛋白与5×蛋白上样缓冲液混匀,100 ℃煮沸5 min,12 000 r/min离心1 min,取上清于10% SDS-PAGE电泳。电泳结束后,蛋白转到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室摇床封闭1 h。分别用兔抗鼠KIF5B(1 ∶1 000),兔抗鼠UCP1(1 ∶1 000),鼠抗人α-tubulin(1 ∶2 000)的一抗杂交液将PVDF膜4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次10 min。山羊抗兔二抗(1 ∶2 000),山羊抗鼠二抗(1 ∶2 000)室温孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,通过ECL法显影。
1.7 统计学分析
实验数据表示为使用SPSS 17.0分析数据,通过不成对的双尾Student’s t检验来比较组间差异,P<0.05表示差异有统计学意义。
总参谋部信息化部
2.1 高脂饲料诱导雌、雄小鼠体重变化差异
实验开始时,正常饲料喂饲的雄性组小鼠体质量[(24.00±1.23)g]与高脂饲料喂饲的雄性组小鼠体质量[(24.60±0.55)g]没有统计学差异(P>0.05,见图1)。正常饲料喂饲的雌性组小鼠体质量[(20.67±1.66)g]与高脂饲料喂饲的雌性组小鼠体质量[(19.67±2.05)g]也不存在统计学差异(P
2.2 高脂饮食对雌、雄小鼠糖代谢的影响差异
为了研究高脂饮食对雌雄小鼠糖代谢的影响,检测了各组小鼠的血糖情况。正常饲料喂饲的雄性组小鼠的血糖[(5.48±0.14)mmol/L]与雌性组小鼠的血糖水平[(5.2±0.21)mmol/L]差异无统计学意义(P>0.05，见图2)。持续12周的高脂饮食,雌、雄小鼠的空腹血糖水平均升高(P<0.05,见图2A)。伴随着血糖水平的升高,血清胰岛素水平也升高(P<0.05,见图3C)。雄鼠的空腹血糖[(8.64±0.17)mmol/L]、血清胰岛素[(0.62±0.06)ng/ml]水平显著高于雌鼠血糖[(6.48±0.19)mmol/L]和血清胰岛素[(0.37±0.18)ng/ml]水平(P<0.05,见图2A和3C)。高脂饲料喂饲的雌、雄小鼠的葡萄糖耐受水平均下降(图2B，2C)。雄鼠的葡萄糖耐受能力受损更为严重,腹腔注射葡萄糖2 h,高脂喂饲的雄性组小鼠较高脂喂饲的雌性组小鼠的血糖水平高0.
5倍(见图2B)。
2.3 高脂饮食对雌、雄小鼠脂代谢、血清脂肪因子水平的影响差异
青海大学农牧学院
为了观察高脂饮食对雌、雄小鼠脂代谢的影响差异,检测了血清甘油三酯和总胆固醇的水平。小鼠的血清甘油三酯水平在饮食和性别方面没有统计学差异(P>0.05,见图3A)。正常饲料喂饲小鼠的血清总胆固醇水平不存在性别差异(P>0.05)。高脂饮食诱导雄、雌小鼠均产生高胆固醇血症,其血清总胆固醇水平分别达到(2.92±0.41)mmol/L和(3.09±0.55)mmol/L(见图3B),但是雌、雄小鼠的血清总胆固醇水平仍差异没有统计学意义(P>0.05,见图3B)。高脂饲料喂饲的雌、雄组小鼠分别较正常饲料喂饲的雌、雄组小鼠的血清脂联素水平偏低,差异没有统计学意义(P=0.095 3，0.153 8)。在任何饮食状况下,小鼠的脂联素水平均不存在性别差异(P>0.05,见图3D)。正常饲料喂饲小鼠的血清瘦素水平不存在性别差异(P>0.05)。高脂饮食诱导血清瘦素水平升高,雄性组小鼠的血清脂联素水平达到(10.40±4.5)ng/ml,雌性小鼠的血清脂联素水平上升到(1.98±0.87)mmol/L。雄性小鼠血清中瘦素水平升高较雌性小鼠更为明显(P<0.05,见图3E)。正常饲料组雌、雄小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度不存在性别差异(P>0.05)。高脂饲料喂饲3个月,雄性小鼠血清中TNF-α浓度增加2倍(P<0.05),雌鼠血清TNF-α浓度增加差异无统计学意义(P=0.297 8,见图3F)。
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