吴有松事件
白血病•淋巴瘤 2020 年11 月第29 卷第11 期Journal of Leukemia & Lymphoma, November 2020，Vol. 29，No. 11 刘芳芳1张厦栋2阎克里1刘伟3
1山西省肿瘤医院药理研究室，太原 030013;2长沙三济生物科技有限公司410205; 3山西省肿瘤医院药学部，太原 030013
通信作者：刘伟，Email:lyglge666@163
【摘要】目的采用基因表达汇编（GE0 )数据库中转录组数据筛选和分析滤泡性淋巴瘤的关键基因。方法通过G E0数据库收集转录组数据集GSE32018和GSE55267。使用R软件行差异分析，筛选 差异表达基因，FunRich 3.13软件分析共同差异基因，Cytascape 3.7.2软件进行滤泡性淋巴瘤相关生物过程和通路分析，筛选与滤泡性淋巴瘤相关的潜在基因，通过分析Oncomine数据库的临床数据进行生存分析，验证所筛选的差异基因。结果通过对GSE32018和GSE55267数据集的差异分析，确定141个上调 基因和199个下调基因，其中筛选出12个关键基因，gp CXCL8、KRT19、CYCS、CDKN3、SFN、RRM2、FN1 、AP0E、CXCL12、VWF、GATA3、TIMP1，其中CYCS、CXCL8和CXCL12与患者早期生存率的关联最为明显。CXCL12过表达和CYCS低表达与患者不良预后相关;CXCL8在淋巴瘤组织中表达下降，但生存分析 中其相对高表达患者出现总生存期缩短的现象，可能与滤泡性淋巴瘤早期发展相关。筛选出G0、KEGG 及Reactome 通路，分别为GO:0001892、KEGG:04115、R-HSA:2559582、GO:0060%8、R-HSA:6785807、GO:0043627、GO:0001936、GO:0043062。结论筛选出的基因CYCSXXCL8 和CXCL12 可能为滤泡性淋巴瘤的研究提供更有效的生物标志物。
【关键词】淋巴瘤，滤泡型；计算生物学；基因表达谱
DOI： 10.3760/l 15356-20200601-00148
Screening and analysis of key genes in follicular lymphoma based on bioinformatics method
Liu Fangfang1, Zhang Xiadong2, Yan Keli1, Liu Wei3
'Department of Pharmacology, Shanxi Provincial Cancer Hospital, Taiyuan 030013, China; 2Department of Changsha Scuiji Biotechnology Co.,Ltd 410205; -^Department of Pharmacy, Shanxi Provincial Cancer Hospital, Taiyuan 030013, China
Corresponding author: Liu Wei, Email:*****************
【Abstract】Objective To screen out and analyze the key genes of follicular lymphoma (FL) according to transcriptome data in Gene Expression Omnibus (GEO) database. Methods Transcriptome datasets GSE32018 and GSE55267 were collected by using GEO database. R software was used for variance analysis to screen differentially expressed genes. FunRich 3.13 software was used to analyze common differential genes. The biological processes and pathways were analyzed with Cytoscape 3.7.2 software to screen potential genes related to the pathogenesis of FL. By analyzing clinical data from Oncomine database for survival analysis, the screened differential genes were verified. Results A total of 141 up-regulated genes and 199 down-regulated genes were identified by differentially analyzing GSE32018 and GSE55267 datasets. Finally, 12 key genes including CXCL8, KRT19, CYCS, CDKN3, SFN, RRM2, FN1, APOE, CXCL12, VWF, GATA3 and TIMP1 were screened out; CYCS, CXCL8 and CXCL12 were closely related with the early survival rate of patients. Overexpression of CXCL12 and low expression of CYCS were found to be associated with poor prognosis of FL patients. CXCL8 expression was decreased in lymphoma tissues, but the relatively high expression of CXCL8 in survival analysis showed shortened overall survival, which might be related to the early development of FL GO, KEGG and Reactome pathways were screened out including GO: 0001892, KEGG: 04115, R-HSA: 2559582, GO: 0060968, R-HSA: 6785807, GO: 0043627, GO: 0001936 and GO: 0043062. Conclusion The selected genes CYCS, CXCL8 and CXCL12 may provide more effective biomarkers for the treatment of FL.
【Key words】Lymphoma, follicular; Computational biology; Gene expression profiling
DOI： 10.3760/cma.jl 15356-20200601-00148
• 655 ••论著•
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8-4 0 4差异倍数1A 40-1.5 生存分析通过 Oncomine 数据库（https ://www . ) 的 “Follicular Lymphoma ” 项的 Dave Lymphoma 数据 获取FL 患者的临床信息，米用GraphPad Prism 8软 件绘制Kaplan-Meier 生存曲线，并行log-rank 检验。2结果2.1差异表达基因的筛选结果分析GSE 32018和GSE 55267两个芯片数据，得 到141个上调基因和199个下调基因（图1 )。滤泡性淋巴瘤（FL )是非霍奇金淋巴瘤（NHL )
最常见的类型之一，在欧美地区占NHL 的20% ~
30%，在亚洲地区发病率较低，不足NHL 的
虽然FL 临床表现为惰性，但绝大多数患者很难治愈。 其病理诊断表现为滤泡中心细胞和中心母细胞的增
生，多为滤泡样结节状生长。FL 在临床和遗传学方面
具有异质性。我们采用生物信息学方法，通过分析基
因表达汇编（GE 0)数据库公共数据集中FL 基因芯
片数据集，筛选出FL 患者异常表达的基因，探索与
FL 相关的生物过程和生物通路，寻FL 潜在的生物
标志物和分子靶标。
1资料与方法
1.1 数据来源
两组基因表达谱数据集包括GSE 32018和
GSE 55267，数据集均从NCBI -GE 0数据库（https :
//www .nrhi .nlm .nih .gov /geo / )获得。GSE 32018 数据集
平台为 GPL 6480Agilent -014850 Whole Human Genome
M icroarray 4x 44K G 4112F ( Probe Name version ),
GSE 55267 数据集平台为 GPL 570 [ HG -U 133_Plu S _2 ]
Affymetrix Human Genome U 133 Plus 2.0 Array 〇
GSE 32018数据集包括6例正常反应性扁桃体样本和
23例FL 患者新鲜冷冻淋巴结样本。GSE 55267数据
集包括4例正常反应性扁桃体纯化的生发中心细胞
和63例FL 患者淋巴结活检组织。
1.2差异表达基因的筛选
所得数据集矩阵均使用R 3.5.1软件读取处理。
所得数据集在分组后均使用liimna 3.38.3软件包的
normalize Between Arrays 函数校正。利用 limma 3.38.3
软件包对两组数据集分别进行显著差异表达基因筛
选，筛选阈值为P < 0.01且丨l 〇g 2倍数变化丨> 1。所得
差异表达基因使用ggpl 〇t 2作图展7K 。比较两组显著
差异表达的基因集合，通过FunRich 3.1.3软件选取
两数据集中差异表达基因的交集。
1.3蛋白质相互作用网络（PPI network )的构
建及关键基因的筛选
通过Cytoscape 3.7软件cytohubba 插件的12种
算法筛选关键基因。并使用STRING 数据库（https :
//string -db .org / )对差异表达基因进行蛋白质网络分析。
1.4差异表达基因的功能富集分析
采用Cytoscape 3.7.2软件clueGO 程序对所确定
差异表达基因进行基因本体（G O )、KEGG 通路以及
Reartome 通路富集分析，选取P <0.05作为显著富集
相关的阈值。通过对富集通路的分组，网络筛选每组vip客户管理
最显著的生物通路。差异倍数 1B □ GSE32018数据集 口（;SE55267数据集图1滤泡性淋巴瘤GSE32018和GSE55267数据集对照正常组织差 异表达基因筛选结果1A:GSE32018数据集差异表达基因火 山图；1B:GSE55267数据集差异表达基因火山图；1C: GSE32018和GSE55267数据集中上调和下调基因数量关系韦 恩图
o o C 3 2 1 (U J s l b o c l 0-(U J )O I b o o
T
白血病•淋巴瘤 2020 年 11 月第 29 卷第 11 期 Journal of Leukemia & Lymphoma^ November 2020，Vol. 29，No. 11• 657 •
2.2关键基因的筛选结果
通过Cytoscape 软件cytohubha 插件每种算法选
取得分最高的10个基因为关键基因（表1)。各差异
表达基因蛋白质网络见图2。
2.3 G O 、K EG G 及R eactom e 通路富集分析结
果
将141个上调基因和199个下调基因分别输入
dueGO 插件，分别得到69个和47个富集通路。将筛
选的关键基因与筛选的富集生物通路联合分析，得到
FL 相关关键基因、生物过程和通路（表2、3 )。筛选出
12 个关键基因，即 CXCL 8、KRT 19、CYCS 、CDKN 3、
SFN 、RRM 2、FN 1、APOE 、CXCL 12、VWF 、GATA 3、
T 1MP 1，其中CYCS 、CXCL 8和CXCL 12与患者早期生
存率的关联最为明显。CXCL 12过表达和CYCS 低表
达与患者不良预后相关;CXCL 8在淋巴瘤组织中表
达下降，但生存分析中其相对高表达患者出现总生存
期缩短的现象，可能与滤泡性淋巴瘤早期发展相关。
2.4生存分析结果
Oncomine 数据库 “Follicular Lymphoma ” 项的 Dave Lymphoma 数据包含191例FL 患者的生存信 息，去除无效数据及偏离的异常数据，按关键基因的注：节点的面积随连通度减小而缩小，节点颜随连通度减小由红 转变为绿
图2通过STRING 数据库得到滤泡性淋巴瘤差异表达基因的蛋白质
相互作用网络
表1通过cytolmhha 插件的12种算法筛选滤泡性淋巴瘤排名前10位关键基因的结果
计算方法 关键基因
Betweenness FN1CXCL8CYCS KRT19VWF THY1GATA3APOE SFN PI3BottleNeck FN1CXCL8CYCS KRT19THY1APOE CDKN3S100A7SERPINB5LCN2Closeness FN1CXCL8THY1
CXCL12CYCS KRT19TIMP1APOE VWF C3Degree FN1CXCL8CXCL12TIMP1MAD2L1THY1C3KRT19KRT5CDKN3EPC FN1CXCL8CXCL12C3TIMP1THY1CCL20APOE KRT14FSTL1M NC FN1CXCL8CXCL12TIM P1THY1C3KRT5MAD2L1CHEK1KRT19Radiality FN1CXCL8CYCS THY1PI3APOE CXCL12VWF HSPD1GATA3Stress FN1CXCL8KRT19CYCS SFN PI3THY1GATA3S100A7VWF M C C MAD2L1PBK KIAA0101ZWINT NCAPG RRM2HMMR OIP5CDKN3NUF2DMNC MND1FANCI HMGB2HMMR ZWINT NCAPG PBK RRM2KIAA0101KRT24EcCentricity SCD CYCS APOE CXCL8FN1LPL GATA3HSPD1HTRA1PI3
ClusteringCoeffirient CEACAM7MND1TMEM30B AP0C1RSP03WTAP FZD5IL32IFI27ZBTB32
表2滤泡性淋巴瘤GSE32018和GSE55267数据集中上调基因相关的核心生物过程及通路
基因序列号生物学功能分级p 值分组P 值相关基因
R-HSA ： 6785807白细胞介素4和白细胞介素13信号转导
0.0010.001COLlA2、FNla 、GATA3a 、IL6R 、TIMPla
GO ： 0043627雌激素反应0.0010.001FSTL1、GATA3a 、GATA6、TIMPla、TNFRSFl 1B
西元国际广场
G 0：0001936内皮细胞增殖的调节<0.01<0.01ACVRL1、APOEa'C D H ll 、CXCL12a 、DYSF 、NR2F2、SULFl、VEGFC
GO ： 0043062细胞外组织结构<0.01<0.01A2M 、AP0C1、AP0Ea 、CETP 、C0L12Al 、C0L1A2、C0L4A1、COL4A2、COL6A3、
CST3、C Y P1B1、FN1a、HTR A 1、LPL、M Y H11、SMOC2、SULF1、TIMP1a 、TNC 、
TNFRSFllB'VWF8
注
洛伦兹力
，关键基因
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100100
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讲60
—低表达（73例）. '—高表达（75例），4() • _P= 0.027 ^20
i i i i * _______580
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—■低表达（75例）@
-----高表达（74例）$40
■P= 0.029 ^20
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•低表达（75例）
.高表达（75例）
P= 0.029
〇12 3 401 2 3 4 0 12 3 4时间（年）时间（年）时间（年）
3A 3B 3C
心灵的微光图3采用生物信息学筛选的Onrrnnine数据库中3个差异表达基因不同表达水平的滤泡性淋巴瘤患者间总生存曲线比较3A:CYCS基因;
3B:CXCL8 基因；3C:CXCL12 基因
表达高低分组，分析患者3年生存情况，结果显示 CYCSXXCL8和CXCL12三个基因不同表达水平的 患者间总生存差异有统计学意义（P值分别为0.027、0.029、0.029 )(图 3 )。
3讨论
随着现代医疗技术和生物技术的发展，越来越多 的基础和临床研究致力于发现FL的潜在机制，为F L 的诊断和提供了更多可能。但目前大多数研究主 要集中在单基因事件上。Ma等^通过生物信息学分 析鉴定CXCR4为多形性成胶质细胞瘤的潜在生物标 志物，并发现CXCR4低表达可能提示患者的总生存 较好。
本研究整合不同时期和不同国家的两个FL转录 组基因芯片数据集，利用生物信息学方法全面分析，确
定了 340个重叠的差异表达基因，包括141个上调 基因和199个下调基因。通路富集分析及蛋白质网络 分析表明，差异表达基因主要参与G0:0001892、KEGG:04115、R-HS A:25595 82、GO:0060968、R-HSA: 6785807、GO:0043627、GO:000 丨936 X0:0043062 过 程的调控，为FL发生、发展的分子机制研究提供了新 见解，并确定了其可能是FL潜在或诊断靶点的 关键基因。我们还使用Om'nmine数据库的临床数据对这些基因进行了验证，筛选出12个关键基因，即CXCL8、KRT19、CYCS、CDKN3、SFN、RRM2、FN1、AP0E、CXCL12、VWF、GATA3、T I M P l j+CYCS、CXCI^ CXCL12与患者早期总生存的关联最为明显。
CXCL12基因编码的蛋白属于a趋化因子家族 成员，是G蛋白偶联受体的配体，在许多不同的细胞 功能中发挥作用，包括胚胎发生、免疫监视、炎症反 应、组织稳态以及肿瘤生长和转移。相关研究发现 CXCL12可增强淋巴瘤细胞的运动能力[3_5]，认为 CXCL12基因可作为FL潜在的靶标[6]。CYCS基 因编码一种血红蛋白，它是线粒体电子传递链的重要 组成部分。目前对CYCS的研究多集中在与血小板减 少相关的疾病中，尚鲜见CYCS在FL中作用的报道。我们的研究表明，CYCS作为p53信号通路的组成基 因，可能与FL有关。FL组织中CYCS的表达低于正 常组织，并且CYCS低表达的患者预后不良，有可能 是FL潜在的生物标志物。CXCL8基因编码的蛋白质 是CXC趋化因子家族的成员，是炎症反应的主要介 质，与CXCL8相关的疾病包括黑素瘤和成年人呼 吸窘迫综合征。CXCL8作为一种重要的多功能细胞 因子，以自分泌或旁分泌方式调节肿瘤的增殖、侵袭 和迁移[7]，与弥漫大B细胞淋巴瘤的进展有关[8]。我 们在分析GEO芯片数据集和临床数据时发现,
表3滤泡性淋巴瘤GSE32018和GSE55267数据集中下调基因相关的核心生物过程及通路基因序列号生物学功能分级p值分组p值相关基因
G0：0001892胚胎胎盘发育<0.01<0.01CDKN3a、E2F8、FZD5、GJB5、HERPUD1、JUNB、KRT19a
KEGG：04115p53信号通路0.0010.001CHEK1、CYCSa、RRM2a、SERPINB5、SFNa
R-HSA： 2559582衰老相关分泌表型（SASP )0.0040.004CDKN2B、CXCL8a、HIST1H3 A、H1ST1H4L、IL1A
00:0060968基因沉默的调控<0.010.001AICDA、CD69、CDKN3a、EIF4E、HISTlH3A、HISTlH4L、NDCl、RNASE7注，关键基因
l(x)复合光缆
80
60
40
20
(
％
)
讲
灶
胡
也
、
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祕
白血病•淋巴瘤 2020 年11 月第 29 卷第11 期Journal of Leukemia & Lymphoma，November 2020，Vol. 29，No. 11• 659 •
CXCL8在淋巴瘤组织中表达下降，但生存分析时其 高表达患者却出现总生存期缩短的现象，表明可能与 该基因在FL早期表达相关，而其在FL发展过程中 变化不明显。
由于FL为惰性淋巴瘤，患者中位总生存时间可 以达到8 ~ 10年，总生存时间个体差异很大，并且随 着疾病的发展以及多种手段的介入，基因与FL 的关系会因多种因素的影响而无法正确表现出来。研 究表明早期FL具有独特的分子和遗传学特征〜，不 同时期FL的基因表达存在差异[〜。所以在生存分析 部分，我们去除了偏离较大的异常数据，将观察时间 限制在3年，以便更有效地发现与FL形成相关的基 因。单一的生物标志物或途径不足以解释肿瘤的发 生机制，致癌作用有着复杂的分子机制[1112]。我们从 差异表达基因中鉴定出CYCS、CXCL8和CXCL12 三个基因。生存分析发现CXCL12
过表达和CYCS低 表达与FL的不良预后相关;CXCL8在淋巴瘤组织中 表达下降，而生存分析中其相对高表达患者出现总生 存期缩短的现象，可能与FL早期发展相关。这种多基 因组合的分析可能为FL的研究提供更有效的生物标 志物。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期：2020-06-01 )
(本文编辑：周薇校对：郎华）
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