•基础研究•
马睿忆董晓婧肖霞雷晓波王健伟
中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所1〇〇730
通信作者：雷晓波，Email:fyleixb@126，电话：************
【摘要】目的探讨新型冠状病毒（severe acute respiratory syn(lrome coronavirus 2, SARS-
CoV-2 )非结构蛋白 1( nonstructural protein 1, NSPl )对I型干扰素（type I interferon, 1FN-I)应答
的影响及其作用机制。方法为研究SARS-C〇V-2的NSP1对I型IFN产生的影响，构建NSP1表达质 粒，并通过免疫荧光检测其蛋白表达能力。通过双荧光素酶报告基因实验检测NSP1对IF N-P启动
子激活的作用。构建NSP1突变体Ml (K163AH164A)和M2(A16卜180)，验证突变位点对IFN-P
启动子激活的影响。结果NSP1显著抑制维甲酸诱导基因蛋白I、黑素瘤分化相关蛋白5、线粒体
抗病毒信号蛋白、TANK结合激酶1、干扰素调节因子3、干扰素调节因子7诱导的下游IFN_p启动子
的激活，并对丨型丨FN通路的各关键分子的蛋白表达具有抑制作用，NSP1C端的KH基序是其发挥抑
制作用的关键位点。结论SARS-C〇V-2N SPl能够拮抗宿主I型干扰素免疫应答，实现病毒的天然
免疫逃逸。
【关键词】SARS-CoV-2; NSP1; I型干扰素
基金项目：国家重点研发计划（ 2020YFA0707600 )；国家自然科学基金（81971948 )；国家
科技重大专项课题（2018ZX10301401 )
DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2021.02.007
道家导引术
SARS-CoV-2 nonstructural protein 1inhibits type-I interferon response
Ma Ruiyi, Dong Xiaojing, Xiao Xia, Lei Xiaobo, Wang Jianwei
Institute o f Pathogen Biology, Chinese Academy o f Medical Science and Peking Union Medical College,
Beijing 100730, China
Corresponding author: Lei Xiaobo, Email:***************,Tel: 0086-10-67855226
【Abstract 】Objective To investigate the effect of nonstructural protein 1(NSP1) of severe acute托克维尔
respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) on the response of type-I interferon (IFN-I). Methods The
expression plasmid of NSP1 was constructed and the protein expression was detected by immunofluorescence
method. The effect of NSP1 on IFN-P promoter activation was detected by dual-luciferase reporter assay
c12蛋白芯片system. The NSP1 mutants Ml (K163AH164A) and M2 (A 161-180) were constructed to verify the effect
of mutated sites on IFN-p promoter activation. Results NSP1 significantly inhibited the activation of
IFN-P promoter induced by retinoid acid-inducible gene I, melanoma differentiation-assoaciated protein 5,
mitochondrial antiviral-signaling protein, TANK binding kinase 1, interferon regulatory factor 3, interferon
regulatory factor 7, and significantly inhibited the protein expression. The KH motif at the C-terminal of NSP1
was the key functional site. Conclusions SARS-CoV-2 NSP1 can antagonize the immune response of type I
interferon and realize innate immune evasion of the virus in host cells.
【Keywords】SARS-CoV-2; NSP1; Type I interferon
Fund programs: National Key R&D Program of China (2020YFA0707600); National Natural
Science Foundation of China (81971948); National Major Science and Technology Project for Control and
Prevention of Major Infectious Disease in China (2018ZX10301401)
DOI：10.3760/cma.j .issn. 1673-4092.2021.02.007
新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019, C O V I D-19)对世界公共卫生和全球经济发 展带来巨大威胁，对新型冠状病毒的致病机制及 抗病毒药物的研究迫在眉睦。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, S A R S-C o V-2)属于冠状病毒科p冠状病毒属，其基因 组为单股正链U N A，大小约29.7 k b，编码非结构 蛋白（nonstructural protein，N S P1-N S P16 )，结 构蛋白（刺突蛋白S，包膜蛋白E，膜蛋白M和 核衣壳蛋白N)以及辅助蛋白0R F(3, 6, 7a,
7b,8, 9b)"1。在病毒进化过程中衍生出一系 列抵御宿主天然免疫反应的策略，一方面避免被 宿主免疫系统的清除，一方面劫持宿主的蛋白表 达体系进行自身的复制和包装。本团队之前的研 究发现S A R S-C〇V-2刺激的I型干扰素（type I interferon,I F N-I)应答存在延迟，包括0R F6在 内的多种病毒蛋白参与了此拮抗过程|21，但各个 病毒蛋白发挥作用的方式仍需进一步研究。之前 的研究发现S A R S-C o V N S P丨通过抑制I型干扰素 的表达来逃脱抗病毒的免疫应答'S A R S-C o V和 S A R S-C〇V-2的N S P1基因序列具有84%的相似 性|41，且S A R S-C u V-2的N S P丨同样抑制宿主细胞 I型I F N的活化，
但其发挥作用的机制未知。本研 究围绕S A R S-C〇V-2 N S P1对I F N通路的拮抗作用 进行探讨。
1材料与方法
1.1 细胞
H E K-293T购自 American type culture collection,
A T C C (货号C C L-11268 ) 0
1.2质粒与抗体
S A R S-C o V-2的N S P1基因（信息来自
I P B C A M S-W H-01/2019新冠毒株，注册编号EPI_ ISL_402123 )由G e n e Designer 丨.0 优化并克隆到 p C M V6-entry 载体质粒。^&8-只10-11\，{^8- M D A5, H A-M A V S,flag-T B K l,flag-I R F3-5D, flag-I R F7, p I F N- (3-Luc和 p R L-T K实验室保存[5】。
Flag抗体（购自Sigma-Aldrich公司，货号F3165 ); P-actin抗体（购自 Sigma-Aldrich公司，货号A5441 );H A抗体（购自Sigma-Aldrich公司，货号 H9658 )；二抗抗体 I R D y e800-labeledIgG和 IRDye680-labeled IgG购自 Li-Cor Biosciences公司。
1.3 细胞培养
H E K-293T细胞用由D M E M、10%胎牛血清、1%青链霉素混合液配制组成的完全培养基进行培养。细胞在37 t，5%C02的条件下培养1~2 d后细胞 密度达到95%以上，进行传代，按1:4的比例进行传代。
1.4蛋白免疫印迹
浓缩铀用l x R l P A裂解细胞提取蛋白，在摇床上裂 解 30 min 后 12 000 r/min, 4 t离心 5 m i n，弃掉沉 淀。上清蛋白定量后加入6 x S D S上样缓冲液，沸 水中煮沸5 min后短暂离心备用。制好的蛋白样品 进行S D S-P A G E凝胶电泳分离蛋白，再转至硝酸 纤维素膜，5%脱脂牛奶37丈封闭30 min, —抗 二抗孵育，P B S T洗涤后，使用Ody s s e y扫描成像。
1.5 免疫荧光
细胞用4%多聚甲醛固定20 m i n，弃去多聚甲醛，P B S浸洗3次，每次10 m i n。加人含0.5% Triton X-100的I^B S缓冲液室温透膜10 m i n。P B S 浸洗3次，每次10 m i n。用含5%B S A的P B S缓 冲液室温封闭，90 m i n后加人稀释好的一抗（含 5%B S A的P B S缓冲液配制，100m U皿），4$孵育过夜。0.1% P B S T浸洗3次，每次10 m i n。二抗 孵育，室温避光孵育60 m i n。0.1%P B S T浸洗3次，
每次 5 m i n。D A P I ( 1:1000 )染 10 m i n。0.1% P B S T浸洗3次后4丈保存。制好的样品在荧光显 微镜下观察采集图像。
1.6 双荧光素酶报告基因实验
293T细胞接种至24孔板，瞬时转染载体质粒 或表达S A R S-C o V-2 N S P1的质粒，以及I F N卩启 动子驱动的荧光素酶报告质粒（p I F N-(3-L u c)和 内参对照质粒（p R L-T K)。转染24 h后测定荧 光素酶活性。用被动裂解液裂解细胞，在摇床上 室温裂解30 m i n，取30 m L细胞提取物加入％孔 U型底板，使用P r o m e g a公司的Dual-LuciferasZ Reporter Assay System (E1%0)进彳了吸光值检测。
2 结果
2.1 N S P1呈剂量依赖性抑制I F N-P启动子的活化
首先根据S A R S-C〇V-2的基因组序列，密码 子优化后合成并构建表达N S P1的p C M V6-entry- N S P1的质粒，转染H E K-293T细胞，免疫荧光检 测N S P1表达，如图1A所示，N S P1成功表达，且在细胞质中分布。为探究N S P1对I型干扰素 启动子活性的影响，将p I F N-p-l u c和p R L-T K 质粒，分别与〇、25、50、100、200和400 n g的 p C M V6-entry-N S P l质粒共转染，同样分别转染维 甲酸诱导基因蛋白 I (retinoid acid-inducible gene I product,R I G-I)N端 C A R D结构域（R I G-I N)、黑
素瘤分化相关蛋白5(11^丨31101113£^6比111丨3^011- assoaciated protein 5, M D A5 )、线粒体抗病毒"[目 号蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein, M A V S)、T A N K结合激酶 1(T A N K binding kinase 1,陈潇的剩余人生店
T B K l )、干扰素调节因子3 (interferon regulatory f a c t o d，I R F3)活化形式（I R F3-5D)、干扰素 调节因子 7 (interferon regulatory factor7，1R F7 )质粒激活干扰素通路，转染24 h后测定萤火虫荧 光素酶与海肾荧光素酶活性值，计算比值，每个 组设置3个复孔。我们发现在R I G-I N、M D A5、M A V S、T B K1、I R F3-5D、I R F7 刺激下可以激活干扰素启动子诱导的荧光素酶的表达，而N S P1抑 制1F N-P的活化，且呈剂量依赖性。蛋白免疫印 迹的结果显示，I F N-P上游的这6个关键靶点分 子的蛋白表达，同样受到N S P1的浓度梯度抑制（图 1B~G)，提示N S P1可通过抑制I型I F N通路关 键分子的蛋白表达，发挥抑制I型干扰素表达的 作用，实现S A R S-C o V-2的天然免疫逃逸。
D D D
图1N SP1不同表达剂量对IFN- P启动子活性影响。A：免疫荧光检测NSP1的表达，绿代表NSP1，蓝代表DAPI 对细胞核的染；B~G：双荧光素酶报告基因检测NSP1对則。-IN、MDA5、MAVS、TBK1、IRF3-5D、IRF7 介导的 IFN-P 启动子 激活的影响及蛋白表达
2.2 N S P1突变体消除对I型干扰素通路的抑制
N S P1通过抑制I型干扰素上游信号通路关键 分子的表达，抑制I F N-p的活化，为探究其发挥 作用的机制，我们查阅分析了 N S P1的蛋白序列 特征。在P冠状病毒属的病毒中N S P1C端的K H 基序是保守区域，S A R S-C o V和S A R S-C〇V-2的N S P丨中均发现K163/H164位置突变后丧失了结合 40S核糖体亚基的能力，N S P1的C端而非N端发挥主要功能161。
福山沙纪鉴于N S P1的C端的重要性，我们构建了
N S P1M l(K163A H164A，氨基酸突变为丙氨酸）和M2 (A 161-180, 161-180位氨基酸缺失）突变体（图2A )。将I F N- p-l u c和p R L-T K质 粒，分别与 〇、25、50、100、200 和 400ng/孔 PC M V6-entry-NSP1质粒与共转染，同时分别转 染R I G-I N、M D A5、M A V S质粒激活下游通路。双荧光素酶报告基因结果显示，相较于野生型的 N S P1，两种突变体M l、M2对丨F N-(3启动子的 抑制作用消失。蛋白免疫印迹结果也显示突变体 M l、M2不抑制R1G-1N、M D A5、M A V S蛋白的表 达（图2B~D)。研究结果提示N S P1的C端对抑 制I F N-p的产生起主要作用，同时K H基序是重 要功能位点。
NSP1
NSP1-M1
(K163AH164H)
NSP1-M2
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NSP1
Variants
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图2 N S P l突变体对丨型干扰素通路的作用
A: NSPl突变体示意图；B~G：双荧光素酶报告基因检测NSPI野 生型及其突变体梯度剂量对R1G-丨N、MDA5、MAVS刺激IFN-P 启动子激活的影响
3讨论
天然免疫是机体抵抗外来人侵的第一道防线，主要在获得性免疫活化之前发挥抗感染作用。病 原微生物侵人机体后诱导天然免疫系统产生天然 免疫应答，包括I型干扰素的产生和炎症反应等。细胞通过模式识别受体识别病原体相关分子模式 激活I型干扰素反应，模式识别受体主要包括4 类：RIG-丨样受体、T o ll样受体、N O D样受体和D N A识别受体。产生的I型干扰素通过自分泌和 旁分泌诱导干扰素下游基因（interferon-stim
ulated
genes，丨S G s)，这些I S G s可以作用于病毒生活周
期的各个阶段，如I F I T M s家族和L Y6E可以抑制 病毒的人侵，R S A D2则抑制脂类物质转运进而抑 制病毒复制，B S T2可以抑制病毒的包装和释放等，最终达到抗病毒作用|71。而病原体为了生存也进化 出一系列天然免疫拮抗机制|81,C0V I D-19患者就 表现出I型干扰素产生低的临床特征p]，这可能是 由于病毒编码的多个蛋白参与到天然免疫的不同 层次和阶段，抑制I型干扰素的产生[2]。如0R F6 通过抑制IR F3和S T A T1进人细胞核，进而抑制I 型干扰素的产生和其下游信号通路；N S P13通过与 T B K1的结合抑制干扰素的产生S A R S-C〇V-2辅 助蛋白0R F%通过与线粒体蛋白T O M M70结合抑 制I型干扰素的产生l H)|;N S P12则通过抑制仙台病 毒介导的I RF3进人细胞核来抑制干扰素的产生|n l。因此，S A R S-C〇V-2通过其编码的蛋白作用于天然 免疫信号通路的多个层次，抑制I型干扰素的抗病 毒反应。我们发现N S P1可以抑制R I G-I样受体信 号通路的 R I G-I N、M D A5、M A V S、T B K1、I R F3- 5D和I R F7介导的天然免疫反应，抑制这些分子 的表达，说明N S P1降低干扰素的产生与其关闭宿 主翻译系统有关。
N S P1的C末端结构域存在2个a螺旋，在 40S小核糖体亚基上与u S3, uS5和r R N A螺旋h l8 段具有高度特异性的相互作用。其中161~180处 的a螺旋与r R N A的h l8相互作用，并在其C末 端与uS5结合
[4】。本研究发现N S P1C端（161~180 尤其是163、164位点氨基酸）对于抑制I型IFN 的激活起主要作用，进一步提示N S P1通过抑制宿 主翻译系统诘抗天然免疫反应。
综上所述，本研究发现S A R S-C〇V-2中非结 构蛋白N S P1抑制天然免疫的作用及其活性位点，为病毒致病机理的阐明以及C0V I D-19药物 的研发提供理论依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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10.1038/s41423-020-00619-y.
(收稿日期：2021-02-14)
(本文编辑：田祎）
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