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收稿日期：2020-12-30基金项目：江苏省科技计划项目（BE2020403）；镇江市科技计划项目（NY2020001）通讯作者：戴忠良（1968-），/0000-0003-1729-372X ，研究员，主要从事甘蓝类蔬菜遗传育种研究工作，E-mail ：dai-zhongliang2008@126 第一作者：秦文斌（1971-），/0000-0001-9944-0118，副研究员，主要从事蔬菜栽培育种研究工作，E-mail ：qinwen-binbin@126
秦文斌，山
福建金融职业技术学院
溪，张振超，姚悦梅，戴忠良*，秦
岭
（江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容
212400）
摘要：【目的】克隆甘蓝bHLH 转录因子（BobHLH121）基因，分析其在不同组织及低温胁迫下的表达模式，为深入研究bHLH 转录因子在甘蓝低温响应中的作用机理提供理论参考。【方法】克隆BobHLH121基因编码区（CDS ）序列，利用生物信息学软件进行预测分析，并构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP 融合表达载体，通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞，观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。采用实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）检测BobHLH121基因在低温胁迫下的相对表达量。【结果】BobHLH121基因CDS 长度为1367bp ，定位于C06染体上，其编码311个氨基酸，蛋白分子量为34.89kD ，理论等电点（pI ）为5.42，不稳定系数为52.29，疏水性平均系数为-0.733，说明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白，且呈酸性，定位于细胞核。BobHLH121蛋白的二级结构主要由α-螺旋（占30.87%）、延伸链（占9.32%）、β-转角（占2.89%）和无规则卷曲（占56.91%）组成，具有保守的HLH 结构域。BobHLH121蛋白与拟南芥（NP_191768.2）、琴叶拟南芥（EFH52923.1）、亚麻荠（XP_01909381.1）、荠菜（XP_023638997.1）、油菜（CDY65446.1）、白菜（XP_009104362.1）和萝卜（XP_018442860.1）等多种植物bHLH 蛋白的氨基酸相似性分别为55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%。系统发育进化树分析结果显示，BobHLH121与拟南芥（NP_191768.2）和琴叶拟南芥（EFH52923.1）bHLH 蛋白在同一小分支上。BobHLH121基因启动子区域存在植物生长发育、非生物胁迫、激素应答和光响应大量的顺式作用元件。BobHLH121基因在叶片的相对表达量显著高于其他组织（P <0.05，下同），在其他组织中的相对表达量均较低。低温胁迫6~12h 时BobHLH121基因的相对表达量较低温处理0h （对照）显著降低，郑百岗
在低温处理24h 时急剧升高，显著高于其他处理时间，低温处理48h 时又显著降低，表明该基因可能在低温胁迫下延迟表达。【结论】BobHLH121基因含有bHLH 家族典型的HLH 保守结构域序列，具有明显的组织表达特异性，可能参与甘蓝叶片的生长发育调控，且响应低温胁迫，可能在甘蓝耐寒性中发挥调控作用。
关键词：甘蓝；BobHLH121基因；亚细胞定位；低温胁迫；基因表达中图分类号：S635.036
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2021）12-3320-10
Cloning ，subcellular localization and expression analysis of
BobHLH121gene from Brassica oleracea L.
QIN Wen-bin ，SHAN Xi ，ZHANG Zhen-chao ，YAO Yue-mei ，
DAI Zhong-liang *
，QIN Ling
（Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area ，Jurong ，Jiangsu 212400，China ）
Abstract ：【Objective 】The whole length of Brassica oleracea L.bHLH transcription （BobHLH121gene ）was cloned
by homologous cloning method ，and its expression pattern under organ/tissue and low temperature stress was analyzed ，which provided theoretical reference for studying the mechanism of bHLH transcription factor in low temperature response.【Method 】The sequence of the coding region （CDS ）of BobHLH121gene was cloned ，the prediction analysis was per-formed using bioinformatics software ，and the pCAMBIA1300-BobHLH121-GFP fusion expression vector was construc-
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0引言
【研究意义】碱性螺旋-环-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）转录因子是一类广泛存在于真核生物中的调节蛋白超家族，其家族成员具有高度保守的HLH结构域（Toledo-Ortiz et al.，2003；Li et al.，2006），通过转录调控或核定位等相关功能激活或抑制相关的下游基因，从而调节植物的生长发
育过程以及生物和非生物胁迫响应（Agarwal et al.，2006a；Feller et al.，2011；Gong et al.，2015）。甘蓝（Brassi-ca oleracea L.）为十字花科芸薹属植物，在我国广泛种植，年种植面积达到90万ha左右，但多为露地栽培，极易遭受冷害、日灼、病虫害等多种非生物和生物胁迫。其中，低温胁迫可改变植物细胞内蛋白结构和活性，从而影响光合作用等一系列酶促反应的速率，最终导致植株叶片萎蔫黄化等现象（Miura and Furumoto，2013）。因此，开展甘蓝bHLH转录因子基因克隆及低温胁迫下表达模式研究，以期挖掘其抗逆基因，对改良甘蓝品种抗性具有重要意义。【前人研究进展】随着不同植物基因组测序的完成，拟南芥（Carretero-paulet et al.，2010）、大白菜（Song et al.，2014）、番茄（Sun et al.，2015；Wang et al.，2015）、苹果（Mao et al.，2017）等植物中bHLH转录
因子家族成员已被鉴定。研究发现，bHLH转录因子参与花青素的生物合成（Toledo-Ortiz et al.，2003；Gonzalez et al.，2008；Pires and Dolan，2010）、生物与非生物胁迫（Sorensen et al.，2003；Hichri et al.，2011）、植物器官发育（Goossens et al.，2017；Taka-hashi et al.，2017）等。bHLH转录因子家族蛋白具有高度保守的bHLH结构域，其长度约为50~60个氨基酸，分为2个不同的区域，即碱性区域和螺旋-环-螺旋区域（HLH），其中，N-端的碱性区域包含13~17个亲水性的碱性氨基酸，具有与DNA识别和结合的位点，参与DNA结合（Mao et al.，2017）。植物感知低温后，会将冷信号通过低温信号转导途径传递下去，最终诱导冷胁迫相关基因的表达，增加植株适应性，而CB
F依赖的冷信号途径普遍存在于高等植物中，现已在拟南芥中发现（刘双等，2017）。拟南芥的ICE （Inducer of CBF expression）是CBF低温响应通道上游的调控基因，编码一个类似MYC bHLH结构的转录因子（Kurbidaeva et al.，2015）。拟南芥中有2个ICE基因（AtICE1和AtICE2），其中AtICE1基因正调控CBF3信号途径，通过与MYB15蛋白互作，抑制MYB15对CBF的负调控作用（Kurbidaeva et al.，2015）；AtICE2基因则通过调节CBF1基因表达来正调控植物的低温响应（Agarwal et al.，2006b）。此
ted through the transfection of tobacco epidermal cells，and the fluorescent signal was observed to determine the subcellu-lar localization of the protein.The relative expression of the BobHLH121gene under low temperature stress was measured using real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）.【Result】The CDS length of BobHLH121gene was1367bp，localized on chromosome C06，encoding311amino acids，protein molecular weight of34.89kD，theoretical isoelectric point（pI）was5.42，the instability coefficient was52.29，and the average hydrophobicity was-0.733，indicating that the protein was an unstable hydrophilic protein，which was acidic and localized in the nucleus.The secondary structure of BobHLH121protein mainly consisted ofα-helix（30.87%），extended chain（9.32%），β-turn（2.89%）and random coil （56.91%），with a conserved HLH domain.BobHLH121protein was closely related to bHLH proteins in Arabidopsis thaliana（NP_1917
68.2），A.lyrata（EFH52923.1），Camelina sativa（XP_01909381.1），Capsella brusa-pastoris（XP_ 023638997.1），B.napus（CDY65446.1），Chinese cabbage（XP_009104362.1）and radish（XP_018442860.1），and had amino acid similarities of55.6%，54.8%，52.0%，50.3%，76.4%，73.9%and61.1%，respectively.Phylogenetic tree analysis showed that BobHLH121was on the same small clade as the A.thaliana（NP_191768.2）and A.lyrata（EFH52923.1）bHLH protein.A large number of cis-acting elements for plant growth and development，abiotic stress，hormone re-sponse，and light response existed in the promoter region of the BobHLH121gene.The relative expression of the Bo-bHLH121gene was significantly higher in leaves than in other tissues（P<0.05，the same below）and lower in all other tis-sues.The relative expression of BobHLH121gene was significantly decreased under low temperature treatment for6-12h under low temperature treatment at0h（control），and increased sharply at24h under low temperature treatment，which was significantly higher than that of other treatments，and decreased significantly at48h under low temperature treatment. It indicated that the gene might be delayed in expression under low temperature stress.【Conclusion】BobHLH121has a conserved HLH domain typical of the bHLH family，has obvious tissue expression specificity，may participate in the re-gulation of growth and development of cabbage leaves，and respond to low temperature stress，may play a regulatory role in cabbage cold tolerance.
Key words：Brassica oleracea L.；BobHLH121gene；subcellular localization；low temperature stress；gene expres-sion
Foundation item：Jiangsu Science and Technology Plan Project（BE2020403）；Zhenjiang Science and Technology Plan Project（NY2020001）
秦文斌等：甘蓝BobHLH121基因克隆、亚细胞定位及表达分析
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外，Li等（2010）研究发现，水稻OrbHLH001基因在拟南芥中过量表达时，显著提高了拟南芥的抗寒能力。Chen等（2012）研究发现，菊花bHLH家族基因CdICE1在低温、干旱和盐胁迫中均具有调控作用。Guo和Wang（2017）研究发现，小麦WbHLH046基因能被低温诱导，在低温胁迫下表达量显著升高。Man等（2017）研究发现，水稻ICE1基因受低温诱导上调表达。【本研究切入点】关于植物bHLH转录因子的结构特点和功能验证等研究已有很大进展，但bHLH家族成员众多，且不同植物bHLH转录因子的结构和调控功能变化多样。目前，甘蓝bHLH转录因子的相关研究鲜少，甘蓝bHLH
转录因子参与非生物胁迫响应的研究在甘蓝中未见报道。【拟解决的关键问题】基于甘蓝bHLH转录因子家族的生物信息学分析结果，利用同源克隆的方法克隆BobHLH121基因编码区（CDS）序列，并通过构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体确定蛋白亚细胞定位情况，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测Bo-bHLH121基因在不同组织及低温胁迫下的相对表达量，为深入研究bHLH转录因子在甘蓝生长发育及低温胁迫的作用机制提供理论参考，对提高甘蓝产量和抗性具有重要意义。
1材料与方法
1.1试验材料
供试的甘蓝材料由江苏丘陵地区镇江市农业科学院提供。总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript1st Strand cDNA Syn-thesis Kit、T4DNA连接酶和pMD18-T质粒载体等均购自TaKaRa公司；DNA回收纯化试剂盒购自诺维赞生物科技有限公司。主要仪器设备：光照培养箱（南京恒裕仪器设备制造有限公司）、PCR仪（苏州东胜兴业科学仪器有限公司）、凝胶成像系统（上海培清科技有限公司）和实时荧光定量PCR仪（QuantStu-dio3，美国）。
1.2试验方法
1.2.1样品采集种子发芽后播种于基质中，在人工气候室中进行生长（白天25℃/夜晚18℃，光照14h/黑暗10h），待植株长至五叶一心时进行4℃低温胁迫处理（每个处理至少选取18株）。将幼苗移至春化室中低温处理0（对照）、6、12和24h后取样，取每株顶端第三片完全展开的叶片，使用液氮迅速冷冻，保存于-80℃冰箱。
1.2.2BobHLH121基因克隆称取2份新鲜叶片0.1g，分别用于RNA和DNA提取。以RNA为模板，
使用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA第一条链。采用CTAB法提取叶片总DNA。
从甘蓝基因组数据库（Bolbase，brassicadb. org/brad/index.php）下载BobHLH121（Bol010854）基因编码区（CDS）序列，使用Primer Premier5.1设计引物（表1），委托金斯瑞生物科技有限公司合成引物。以甘蓝叶片DNA为模板进行BobHLH121基因的扩增。反应体系：10×PCR Buffer2.0μL，40ng/μL DNA模板1.0μL，10μmol/L正、反向引物（Bob-HLH121-1-F/BobHLH121-1-R）各1.0μL，2mmol/L dNTP2.0μL，25mmol/L MgCl22.0μL，Taq聚合酶0.25μL，ddH2O补足至20.0μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃60s，进行35个循环；72℃延伸7min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并使用凝胶成像仪拍照。利用PCR 产物回收试剂盒回收纯化目的片段，将其连接至pMD18-T后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。使用LB培养基（含氨苄青霉素）进行菌落筛选，挑选阳性克隆送往南京斯普金生物科技有限公司进行测序。
1.2.3生物信息学分析在甘蓝基因组数据库中搜索BobHLH121基因的CDS、DNA和蛋白序列，利用NCBI数据库BLAST搜索同源序列。使用MEGA6.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树，Bootstrap值设置为1000，其他参数为默认值。使用ExPASy（/prot-param/）预测蛋白的理化性质。使用Mapchart绘制BobHLH121基因在染体上的位置。利用New PLACE（sogo.jp/）分析BobHLH121起始密码子上游2000bp序列中顺式作用元件；使用SOPMA（npsa-pbi.libcp.fr/cgi-bin/secpred-sop-ma.pl）预测蛋白二级结构；使用Plant-mPLoc（ www.csbio.sjtu.edu/bioinf/plant-multi/）、BacelLo （gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm）和Pre-dictProtein（/）进行Bo-bHLH121亚细胞定位预测。
1.2.4BobHLH121基因在不同组织及低温胁迫下的表达分析BobHLH121基因在甘蓝不同组织中的表达数据均从NCBI的GEO数据库下载（登录号：GSE42891）。根据BobHLH121基因序列，设计实时荧光定量PCR的特异引物（BobHLH121-2-F/Bo-bHLH121-2-R）（表1），选用甘蓝GAPDH为内参基因（Brulle et al.，2014），并委托金斯瑞生物科技有限公司合成引物。以甘蓝叶片的cDNA第一条链为模板，使用荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq TM
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II ，检测BobHLH121基因在不同低温处理时间下的表达量。反应体系：40ng/μL cDNA 模板1.0μL 、0.2μmol/L 正、反向引物（BobHLH121-2-F/BobHLH121-2-R ）各1.0μL ，SYBR Premix Ex Taq 10.0μL ，ddH 2O 补足20.0μL 。PCR 扩增采用两步法：95℃5s ，60℃20.0s ，进行40个循环；熔解曲线分析：95℃15s ，60℃1min ，95℃1s 。
1.2.5亚细胞定位根据BobHLH121基因序列设计带有酶切位点的引物（BobHLH121-3-F/Bo-bHLH121-3-R ）（表1），以携带目的基因序列的克隆载体pMD18-T 为模板进行PCR 扩增，回收纯化目的片段。分别使用Sac I 和Xba I 酶切带有荧光蛋白（GFP ）基因的质粒载体PCAMBIA2300-GFP 和目的片段，然后用T4连接酶连接，构建融合表达载体PCAMBIA2300-GFP -BobHLH121（贺丹等，2021），将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，测序结果正确的质粒转化根瘤农杆菌GV3101。将农杆菌菌液注射烟草叶片，暗培养72h 后在激光共聚焦显微镜下观察叶片中荧
光信号。1.3统计分析
根据2-ΔΔC t 法计算BobHLH121基因的相对表达量。采用GraphPad Prism 5.0整理分析数据及绘图。
2结果与分析
2.1
BobHLH121基因克隆结果
以甘蓝叶片DNA 为模板进行PCR 扩增，结果如图1所示。BobHLH121基因CDS 长度为1367bp ，编码311个氨基酸残基。回收目的条带的测序结果与甘蓝基因组数据库中Bol010854基因CDS 的序列完全一致，表明克隆片段为目的基因。2.2染体定位结果
在甘蓝基因组数据库中搜索BobHLH121基因信息，结果发现该基因定位于C06染体上（图2），基因位置信息为C06:16463282-16464648（-），属于MF2亚组上的反义链基因。BobHLH121是个双拷贝基因，与白菜和拟南芥的同源基因之间具有相同的共线性区块（图3）。
引物名称Primer BobHLH121-1-F BobHLH121-1-R BobHLH121-2-F BobHLH121-2-R BobHLH121-3-F BobHLH121-3-R GAPDH-F GAPDH-R
引物序列Primer sequence
生物组织脱水机5'-ATGGAGCTTGTGTTTGAGAACGGG-3'5'-CTAGATTTCTTACCTGAGAGAGATCCTCCAT-3'
5'-TTGGGGTTTGACTCTAC-3'5'-CAACATCATTGCTGGTG-3'
5'-AGAACACGGGGGACGAGCTCATGGAGCTTGTGTTTGAGAACGGG-3'5'-ACCATGGTGTCGACTCTAGATTTCTTACCTGAGAGAGATCCTCCAT-3'
吉林大学法学院5'-TCCACCATTGATTCTTCTCTG-3'5'-TCAGCCAAATCAACAACTCTC-3'
用途Usage 克隆表达亚细胞定位内参基因
表1试验所用的引物序列信息
Table 1Information on the primer sequences used for the test
图1BobHLH121基因的PCR 扩增结果
Fig.1PCR amplification product of BobHLH121gene
M ：DL5000DNA Marker ；1~2：BobHLH121基因的全长扩增条带Full-length amplification product of BobHLH121gene武汉工学院
图2BobHLH121基因的染体位置
Fig.2The chromosome position of BobHLH121
gene
M
1
2
1000bp
C06
0.0
16.5
40.7
end BobHLH121start
图3
BobHLH121基因与白菜和拟南芥同源基因的共线性
关系
Fig.3Collinearity of BobHLHL121gene with homologous
gene of Brassica oleracea ，B.rapa and Arabidopsis tha-liana
At ：拟南芥；Bo ：甘蓝；Br ：白菜
At ：A.thaliana ；Bo ：B.oleracea ；Br ：B.
rapa
秦文斌等：甘蓝BobHLH121基因克隆、亚细胞定位及表达分析
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2.3启动子顺式作用元件分析结果
利用PlantCARE数据库预测BobHLH121基因的上游2000bp启动子区域的顺式作用元件，结果（表2）显示，BobHLH121基因的启动子区域存在大量的顺式作用元件，主要分为植物生长发育、非生物胁迫、激素应答和光响应四种类型。
2.4理化性质分析和二级结构预测结果
根据ExPASy在线工具推测BobHLH121蛋白的分子式为C1510H2389N421O494S17，分子量为34.89kD，理论等电点（pI）为5.42，不稳定系数为52.29，疏水性平均系数为-0.733，说明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白，且呈酸性。使用SOPMA在线工具预测Bo-bHLH121蛋白的二级结构，结果如图4所示。Bo-bHLH121蛋白的二级结构比较丰富，主要由α-螺旋（占30.87%）、延伸链（占9.32%）、β-转角（占2.89%）和
无规则卷曲（占56.91%）组成，说明α-螺旋和无规则卷曲是该蛋白多肽链中主要的结构元件。
2.5序列比对及同源分析结果
SMART分析结果显示，BobHLH121蛋白具有保守的HLH结构域（图5）。通过NCBI数据库BLAST 搜索BobHLH121蛋白的同源序列，结果发现Bo-bHLH121蛋白与拟南芥（NP_191768.2）、琴叶拟南芥（EFH52923.1）、亚麻荠（XP_01909381.1）、荠菜（XP_ 023638997.1）、油菜（CDY65446.1）、白菜（XP_ 009104362.1）和萝卜（XP_018442860.1）等多种植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分别为55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%（图6）。由图7可知，BobHLH121与拟南芥（NP_191768.2）和琴叶拟南芥（EFH52923.1）bHLH蛋白在同一小分支上。
类型Type
光响应Light response
生长与发育Growth and development 胁迫响应Stress response
激素响应Hormone response
控制元件cis-acting elements
Box4、GT1-motif、G-box、MRE、TCT-motif ARE、GCN4_motif、MBS、O2-site
LTR、TC-rich repeats、WUN-motif ABRE、GARE-motif、P-box、TCA、TCA-element，
表2BobHLH121基因的启动子区域顺式作用元件
Table2Promoter region cis-acting element of BobHLH121gene
图4BobHLH121蛋白的二级结构预测结果
Fig.4The prediction of secondary structure of BobHLH121
protein
2.6亚细胞定位分析结果
Plant-mPLoc、BacelLo和PredictProtein预测结果均显示，BobHLH121蛋白定位于细胞核中。将PCAMBIA2300-GFP-BobHLH121融合表达载体通过农杆菌介导转染烟草叶片表皮细胞，从而获得烟草瞬时表达体系，通过观察荧光信号发现对照组细胞核和细胞质可见明显的绿荧光，处理组仅在烟草表皮细胞的细胞核检测到绿荧光信号，即BobHLH121蛋白定位于细胞核中（图8），表明Bo-bHLH121具有核蛋白的功能。
2.7BobHLH121基因组织表达分析结果
BobHLH121基因在甘蓝愈伤组织、根、茎、叶、芽、花和角果中的表达模式如图9所示。BobHLH121基因在不同组织中的相对表达量存在明显差异，其中在叶片的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05，下同），在其他组织中的相对表达量均较低，尤其是在花中的相对表达量最低，表明BobHLH121基因可能参与甘蓝叶片的生长发育调控。
2.8BobHLH121基因在低温胁迫下的表达分析结果
对BobHLH121基因在低温胁迫下甘蓝幼叶中的表达模式进行分析，结果如图10所示。低温胁迫6~12h时BobHLH121基因的相对表达量较低温处理0h（对照）显著降低，低温处理24h时相对表达量急剧升高，显著高于其他处理时间，低温处理48h时又图5BobHLH121蛋白的HLH结构域
Fig.5HLH domain of BobHLH121protein
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