预设与生成
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2020, 46(10): 1526-1538 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@caas
本研究由国家重点研发计划项目(2017YFD0200100, 2017YFD0200103)资助。
This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0200100, 2017YFD0200103).
*
通信作者(Corresponding author): 张振华, E-mail: zhzh1468@163 **
同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者: 肖燕, E-mail: xiaoxiaoY8432@163; 姚珺玥, E-mail: yjy950606@126欧v客车
Received (收稿日期): 2019-12-16; Accepted (接受日期): 2020-04-15; Published online (网络出版日期): 2020-05-07. URL: knski/kcms/detail/11.1809.s.20200506.1831.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94197
肖 燕** 姚珺玥** 刘 冬 宋海星 张振华*
湖南农业大学资源环境学院 / 南方粮油作物协同创新中心, 湖南长沙 410128
摘 要: 随着人们对作物产量的需求不断提高, 氮肥被过量施用, 而作物的氮素利用率(NUE)却在不断降低。本研究从低氮胁迫下油菜的生理变化入手, 结合高通量的数字基因表达谱测序技术, 分析了油菜在低氮0、3、72 h 下的转录组差异响应, ﹑鉴定了氮的吸收﹑转运分配和转录因子等方面的差异表达基因。结果表明, 甘蓝型油菜在低氮处理后, 氮优先分配到地上部, 硝酸还原酶(NR)活性显著降低, 而谷氨酞胺合成酶(GS)活性升高, 油菜植株总氮浓度降低, NUE 升高。基因基因本位论(GO)功能与京都基因和基因组百科全书(KEGG)代谢通路分析表明, 地上部差异表达基因主要是参与代谢过程、蛋白结合、离子结合、阴离子结合等, 根中差异表达基因主要是参与分子功能、初级代谢过程、离子结合、阴离子结合等。基因表达谱分析表明, 低氮胁迫72 h 后, 根中BnaGLNs 家族基因表达大部分升高; 根中BnaWRKY33s 和BnaWRKY70s 的基因表达量降低; BnaMYB4s 、BnaMYB44s 和BnaMYB51s 亚家族中的大部分基因的表达量降低; BnaNIAs 家族中的大部分基因表达上调; 在BnaNRT2.1s 和BnaNRT3.1s 亚家族中, 根中BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04560D)、BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04570D)、BnaA2NRT3.1 (BnaA02g11760D)、BnaC2NRT3.1 (BnaC02g16150D)的表达上调。同时, 地上部和 根发生外显子跳跃(SE), 外显子选择性跳跃(MXE)类型的可变剪接积极加强对低氮的适应。总而言之, 在低氮处理下, 甘蓝型油菜可以通过调控BnaNRTs 、BnaGLNs 、BnaNIAs 家族基因提高NUE , 以及调控BnaMYBs 、BnaWRKYs 家族和可变剪接积极适应低氮胁迫。 关键词: 甘蓝型油菜; 低氮胁迫; NO 3-; 可变剪接
Expression profile analysis of low nitrogen stress in Brassica napus
XIAO Yan **, YAO Jun-Yue **, LIU Dong, SONG Hai-Xing, and ZHANG Zhen-Hua *
College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University / Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, Hunan, China
Abstract: The nitrogen fertilizer was overapplied with people’s increased demand for crop yield, but the nitrogen utilization effi-ciency (NUE) of crops was decreasing. In this study, the differentially expressed genes (DEGs) including the nitrogen absorption, transport, distribution and transcription factors were screened under low nitrogen treatment of 0, 3, and 72 h by the physiological changes and RNA-Seq in rapeseed. The results showed that nitrogen were preferentially allocated to the shoots with the increased glutamine synthetase (GS) and NUE activities and the decreased nitrate reductase (NR) activity and the total nitrogen concentra-tion under low nitrogen treatment. The analy
sis of Gene Ontology (GO) enrichment and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) metabolic pathway showed that DEGs of the shoots were mainly involved in metabolic process, protein binding, ion binding, and anion binding, while DEGs of the roots were mainly involved in molecular function, primary metabolic process, ion binding, and anion binding. The gene expression profile analysis indicated that after low nitrogen treatment for 72 h, the ex-pression of most genes in BnaGLNs increased; the expression of BnaWRKY33s and BnaWRKY70s showed significantly decreased in roots; the expression of most genes in BnaMYB4s , BnaMYB44s , and BnaMYB51s decreased in the roots; the expression of most genes in BnaNIAs family was up-regulated in roots; and in the subfamily of BnaNRT2.1s and BnaNRT3.1s , the expression of BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04560D), BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04570D), BnaA2NRT3.1 (BnaA02g11760D), and BnaC2NRT3.1
第10期肖燕等: 甘蓝型油菜响应低氮胁迫的表达谱分析1527 (BnaC02g16150D) increased significantly in roots. At the same time, skipped exon (SE) and mutually exclusive exons (MXE)
type occurred in shoots and roots in order to have a better adaptation under low nitrogen stress. In conclusion, the NUE activity was increased by regulating BnaNRTs, BnaGLNs and BnaNIAs genes, and the BnaMYBs, BnaWRKYs genes and alternative splic-
美语俚语ing favored Brassica napus to adapt the low nitrogen stress.
Keywords:Brassica napus; low nitrogen stress; NO3-; alternative splicing
氮(N)是植物生物量和作物产量必需的营养元素[1]。植物必须从土壤中获取丰富的氮资源, 以满足植物正常生理发育。在我国农业生产中, 氮素利用效率(NUE)比较低, 每年需要施用大量氮肥以维持作物生产力。而氮肥的过量施用造成一定的资源浪费, 并对环境构成污染, 因此在减少施氮量的同时提高NUE是可持续农业和生态系统良性发展的关键。
低氮胁迫下, 植物可以通过诱导根生长来增加对氮的吸收[2], 氮高效的水稻品种通过诱导NO3-转运子使地上部累积更多的氮, 来促进光合作用, 提高碳、氮同化效率[3]。与谷类作物不同, 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)对最优种子产量具有相对较高的N营养需求[4-5], 合适的氮水平可以促进光合效率, 并增加干物质累积量[7], 而适当的低氮处理可以增加油菜的NUE[6]。事实上, 尽管油菜具有强大的NO3-吸收能力, 但油菜仍然是目前已知作物中NUE 最低的[7]。
甘蓝型油菜(Brassica napus, AnAnCnCn, 约1345 Mb, 2n = 4x = 38)属于十字花科芸薹属油料作物[8], 全基因组包含约十万多个蛋白编码基因, 由白菜(Brassica rapa, ArAr, 约485 Mb, 2n = 2x = 20)和甘蓝(Brassica oleracea, CoCo, 约630 Mb, 2n = 2x = 18)这2个二倍体基本种通过天然远缘杂交形成的异源四倍体作物[9]。本研究中采用的油菜品种为湘油15号, 是由湘油10号为父本, 湘油11号为母本杂交, 经
多年选育的双低油菜, 是一种高NUE品种[10]。
近年来, 伴随测序技术的迅猛发展和测序成本的大幅下降, 高通量测序已经成为植物基因组和转录组(或数字基因表达谱)等众多组学研究的首选分析测试手段, 极大地推进了基因组学和分子生物学等多种学科领域的研究进展。已有学者对多份谷子核心种质在低氮处理下的表型进行了分析, 并选择耐低氮的品种进行了转录组测序分析, 进而筛选到可能参与低氮胁迫响应的基因并进行后续试验分析[11]。并且不少研究表明, 转录因子在植物生命活动中起着非常重要的作用, 转录因子可以通过调控相应基因的表达来适应非生物胁迫[12-14]。
虽然越来越多的研究从组学入手, 深入解析植物在低氮胁迫下的响应[15-16], 但是关于NUE高效油菜在低氮胁迫下的转录响应的研究比较少。本研究鉴定了在低氮处理下甘蓝型油菜产生的异常形态与生理生化紊乱。随后, 利用高通量的数字基因表达谱测序技术分析了油菜在低氮0、3、72 h下的转录组差异响应, ﹑﹑
鉴定了氮的吸收转运分配和转录因子等方面的差异表达基因。该研究旨在提高对油菜响应低氮胁迫的分子机制认识, 为鉴定和培育适应低氮的NUE高效的作物种质资源提供部分理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
选用油菜品种湘油15号 (XY15), 由国家油料改良中心湖南分中心提供。
1.2营养液培养试验
试验在本课题组油菜光照培养室中进行。温度设置为22℃, 光照周期为14 h光照/10 h黑暗, 光照强度为300~320 μmol m-2 s-1, 湿度为60%~75%。选取大小一致、籽粒饱满的油菜种子, 使用1%的NaClO灭菌处理10 min; 将种子表面冲洗干净后, 4℃避光条件下用超纯水浸泡种子24 h。将浸泡过后的种子均匀播于纱布上用超纯水育苗。育苗1周后, 将长势一致的幼苗移栽至盛有10 L营养液的黑塑料盆中。
营养液试验中的大量元素营养液采用Hoagland 配方, 微量元素营养液采用Arnon配方[17]。每隔5 d 更换1次营养液, 初始营养液为1/4浓度营养液, 随后为1/2浓度营养液, 最后为全量营养液。试验设置正常氮水平(NO3- 9.0 mmol L-1)和低氮水平(NO3-
0.3 mmol L-1) 2个氮水平。
1.3取样及测定方法
采用Hoagland溶液进行水培油菜幼苗, 在整个试验过程中不断曝气, 每隔5 d更新一次[18]。以正常氮水平(NO3- 9.0 mmol L-1)水培油菜品种湘油15号(XY15)的幼苗10 d, 然后转移到低氮水平(NO3-
1528作物学报第46卷
0.3 mmol L-1)。在0、3和72 h后分别对XY15幼苗的地上部和根进行取样。将新鲜根和叶研磨成细粉(约100 mg), 然后提取并用Ehlting等[19]描述的分光光度法测定NR活性。用Wang等[20]报道的方法测定GS活性。根据Patterson等[21]的研究, 在410 nm 处用分光光度法测定了油菜根和叶中NO3-的浓度。用Wang等[22]报道的方法测定了油菜的总氮含量。根据Li等[23]的计算方法, NUE = 总生物量/总氮积累。
1.4数字基因表达谱分析
采用高通量的数字基因表达谱测序进行全基因组的基因表达分析, 测序平台为Illumina HeSeq 4000平台上的高通量转录组测序(NooGeNe, 中国北京), 测序方式为单端测(single-end, SE), 单条reads读长为50 bp, 单个样品的测序reads数目为20 M条, 单个样品获得的数据量约为1.2 Gb。
由于原始测序数据可能包含低质量序列和接头序列等, 为保证信息分析结果的可靠性, 需要经过一系列数据处理来过滤这些包含杂质的raw reads, 具体步骤如下: (1)去除含adapter的reads; (2)去除含N (表示无法确定碱基信息)比例大于10%的reads; (3)去除低质量reads (质量值Q≤5的碱基数占整条read 的50%以上)。过滤后的数据称为clean reads。
利用Euclidean距离算法计算各个样品基因的表达量距离, 利用离差平方和(Ward)算法计算样品间的距离, 根据距离大小建立聚类图。聚类图能直观的反映出样品之间的距离关系和差异关系, 聚类图的纵坐
标表示聚类树中的高度, 高度接近的生物学样品容易聚在一起。在基因表达的聚类分析中, 本研究利用Cluster软件[24], 以欧氏距离为矩阵计算公式, 对样品表达基因和样品方案同时进行分层聚类分析, 聚类结果用JavaTreeview[25]显示。在基因表达的聚类图中, 每列代表一个生物学样本, 每行代表一个基因, 不同表达量用不同的颜表示, 红表示高表达, 蓝表示低表达。基因的GO功能注释使用WEGO软件[26]进行分析, 从宏观上认识基因的功能分布; 本研究使用KEGG[27]公共数据库对基因Pathway富集分析。使用NOISeq方法鉴定不同时间低氮处理之间的差异表达基因[28], 其筛选标准为: |log2 Fold-change|≥2且FDR < 0.05。
基因表达定量的结果以FPKM为单位, 具体计算公式如下: FPKM=106C/(NL/103)。设FPKM(A)为基因A的表达量, 则C为比对到基因A的Fragments数, N为比对到参考基因的总Fragments 数, L为基因A编码区的碱基数。FPKM法能够消除基因长度和测序量差异对基因表达的影响, 计算得到的基因表达量可直接进行不同样品间的基因差异表达分析。基因表达谱的热图谱由Multiexperiment Viewer (MEV, / mev.html)描绘[29]。
1.5数据处理
采用SPSS 19.0统计分析软件进行方差分析和相关分析, 不同处理间采用最小显著差数法(LSD法)进行差异显著性检验(P < 0.05), 采用Microsoft Ex-cel进行数据整理和作图。
2结果与分析
2.1甘蓝型油菜响应低氮胁迫的生理差异
当NO3-供应不足时, 植物对有限的氮生长条件产生一系列适应性反应[30]。以油菜为试材, 生长10 d 后, 在低氮 (0.30 mmol L-1 NO3-)条件下进行水培试验, 测定了油菜对氮限制的生理反应。详细研究了植物对短期(3 h)和长期(72 h)低氮(0.30 mmol L-1)胁迫的反应。由图1-A可知, 在低氮处理下, 氮资源优先分配到地上部, 以满足光合作用的需要。氮代谢相关酶分析结果表明, NR活性在根和地上部中均显著降低(图1-E), 而GS活性在低氮处理下升高(图1-F)。低氮处理3 h生物量较低氮0 h无显著差异, 低氮处理72 h后, 其生物量较低氮0 h和3 h显著增加(图1-D), 在低NO3-条件下处理3 h后, 随着氮素限制时间的延长, 油菜植株总氮浓度显著降低(图1-B), 而氮素耗竭则提高了油菜植株的NUE (图1-C)。与充足的NO3-供应相比, 低氮诱导了油菜植株显著的生理变化。
2.2甘蓝型油菜全基因组数字基因表达谱
为了鉴定甘蓝型油菜在全基因组水平上对低氮胁迫的分子响应, 我们利用Illumina HeSeq 4000 (NooGeNe, 中国北京)进行高通量的数字基因表达谱测序。其中转录组原始序列测序数据已经上传至NCBI (bi.v/)的SRA ( bi.v/sra/?term=)中, 其中BioProject ID为PRJNA340053。在去除接头序列和低质量的reads后, 每个测序样品获得4.2×107至 5.
7×107条reads, 碱基质量值Q20均在96%以上, Q30均在91%以上, GC含量也均在45%以上, 错误率均在0.02%以下(表1)。
第10期
肖燕等: 甘蓝型油菜响应低氮胁迫的表达谱分析 1529
图1 油菜对氮(N)胁迫的生理响应
Fig. 1 Physiological responses to nitrogen (N) stress in oilseed rape
A: 根部NO 3-浓度与地上部NO 3-浓度的比值; B: 植株总N 浓度; C: 氮利用效率(NUE), NUE=总干重/总N 含量; D: 总生物量(单株植物干重 DW); E: 地上部和根部硝酸还原酶(NR)活性; F: 地上部和根部谷氨酰胺合成酶(GS)活性。数值表示平均值(n = 5), 误差条表示标准误差(SE)值。
A: the ratio of root NO 3- concentration to shoot NO 3- concentration; B: the total N concentration; C: the nitrogen use efficiency (NUE) value, NUE = total dry weight / total N content; D: the total biomass (per plant dry weight DW); E: the nitrate reductase (NR) activity in shoots and roots; F: glutamine synthase (GS) activity in shoots and roots. Data present means (n = 5), the error bars denote the standard error (SE) value.
表1 数字基因表达谱测序数据概况杯芳烃
Table 1 Overview of the digital gene expression (DGE) profiling sequencing data
样本名 Sample name
下机原始reads 数目 Raw reads
高质量 reads 数目 Clean reads
过滤后高质量数据碱基总数
Clean bases
测序错误率Error rate (%)
碱基质量值达到Q20以上的碱基
Q20 (%) 碱基质量值达到 Q30以上的碱基
Q30 (%) 过滤前(后)的序列 碱基GC 比例 GC content (%)
S0 596,35,738 57,043,591 8.55 0.01 97.05 92.59 47.49 R0 49,108,674.67 47,000,152 7.05 0.02 97.13 92.83 46.14 S3 58,163,928.67 55,612,390 8.34 0.02 97.15 92.79 47.61 R3 44,434,570 42,606,356 6.39 0.02 96.85 92.17 45.61 S72 55,942,618 53,982,678 8.10 0.02 96.72 91.64 47.07 R72 50,080,180 48,523,315 7.28 0.02
97.05
92.46
46.26
S0和R0分别表示未做低氮处理的地上部和根; S3和R3分别表示低氮处理3 h 后的地上部和根; S72和R72分别表示低氮处理72 h 后的地上部和根。
S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h under low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h under low nitrogen treatment, respectively.
为了评估低氮处理同一时间下3个生物学材料之间的相关性, 通过每2个生物学重复之间标准化的表达谱, 计算得出它们的Pearson 相关性系数。结果表明, 在同一处理下的地上部或者根系中, 每2个生物学重复之间的相关性系数基本都在0.95以上(图2)。
基因表达差异的分析以低氮处理0 h 作为对照, 低氮处理3 h 和72 h 后, 地上部分别检测到12,719
个和10,066个差异表达基因; 根中分别检测到9204个和13,400个差异表达基因。低氮3 h 和72 h 下, 分别在地上部特异性地检测到5677个和3550个差异表达基因; 根中特异性地检测到3359个和5832个差异表达基因(图3)。
为了进一步鉴定差异表达基因的生物学功能, 本研究进行了基因GO 功能与KEGG 代谢通路分析。差异表达基因富集分析结果表明, 低氮处理72 h 的
1530作物学报第46卷
寄语市长
归化城图2油菜幼苗地上部和根系的Pearson相关性系数热图
Fig. 2 Heatmap of Pearson correlation coefficient values in the shoots and roots of Brassica napus seedlings
S0和R0分别表示未做低氮处理的地上部和根; S3和R3分别表示低氮处理3 h后的地上部和根; S72和R72分别表示低氮处理72 h 后的地上部和根。
S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h under low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h under low nitrogen treatment, respectively.
图3低氮0, 3, 72 h下油菜地上部和根的差异表达基因
Fig. 3 Differentially expressed genes (DEGs) in the shoots (S) and roots (R) of Brassica napus seedlings at 0, 3, and 72 h under low nitrogen treatment
A: 差异表达基因的维恩图分析; B: 差异表达基因数目。S0和R0分别表示未做低氮处理的地上部和根; S3和R3分别表示低氮处理3 h后的地上部和根; S72和R72分别表示低氮处理72 h后的地上部和根。
A: the venn-graph analysis of the DEGs; B: the number of the DEGs. S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h under low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h under low nitrogen treatment, respectively.
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