深圳职业技术学院图书馆作者：陈俊洁 梅松 胡彦如
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摘 要：脱落酸（abscisic acid，ABA）激素是一类重要的生长调节物质，参与调控植物的多种生理过程。花青素（anthocyanins）是植物次生代谢产生的类黄酮化合物，对植物的生长发育和逆境胁迫响应有重要作用。该文以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为研究对象，探讨ABA信号对花青素生物合成的调控功能和作用机制。结果表明：外源施加ABA显著提高野生型幼苗茎尖中花青素的积累。相一致的是，ABA能诱导某些与花青素合成相关的转录因子及合成酶基因的表达。遗传学分析发现，ABA诱导花青素合成部分依赖于MBW复合体中的核心转录因子，如TTG1、TT8及MYB75等。初步机制研究揭示，ABA信号途径中的bZIP类转录因子ABI5能与TTG1、TT8及MYB75等相互作用形成蛋白复合物。综上结果认为，ABA信号诱导拟南芥幼苗中花青素的积累，并可能通过ABI5与MBW复合体协同作用调控花青素的合成。 禤沛钧 关键词：拟南芥， 脱落酸， 花青素， ABI5转录因子， MBW复合体
中图分类号：Q943
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2020）08-1169-12
Abstract：Abscisic acid （ABA） is a critical phytohormone and widely modulates various biological processes in plants. Anthocyanins are flavonoids produced by plant secondary metabolism and play crucial roles in plant growth and stress responses. Recently， several transcription factors and synthetase genes involved in anthocyanins biosynthesis have been well studied; however， the upstream regulatory signals mediating their synthesis remain to be further explored. In this study， we taken Arabidopsis thaliana as the research object and investigated the function and mechanism of ABA in the control of anthocyanin biosynthesis. Phenotypic analysis showed that exogenous application of ABA significantly increased the accumulation of anthocyanins in the stem ends of wild-type A. thaliana seedlings. Consistently， ABA induced the expression of certain transcription factors and synthetase genes associated with anthocyanin synthesis. In addition， genetic analysis revealed that ABA-stimulated anthocyanin synthesis is partially dependent on core transcription factors in the MBW complex that positively regulates anthocyanin synthesis， such as TTG1， TT8， and MYB75. Preliminary mechanism studies revealed that the bZIP-type transcription factor A
BI5 in the ABA signaling pathway physically interacts with TTG1， TT8 and MYB75 to form a protein complex. Taken together， this study shows that ABA signaling induces anthocyanin accumulation in A. thaliana seedlings and may regulate the synthesis of anthocyanins by synergizing the ABI5 with the MBW complex.
Key words：Arabidopsis thaliana， ABA， anthocyanin， ABI5 transcription factor， MBW complex
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花青素是植物次级代谢产生的一类水溶性天然素，属于类黄酮化合物，在食品营养和医药保健中具有重要的应用价值（Peiffer et al.， 2016;Wei et al.， 2018）。它广泛存在于被子植物中，是植物生长过程中形成的重要成分。花青素在提高植物耐逆境胁迫能力方面发挥重要作用，对植物生长繁殖及对环境适应有重要意义（Rowan et al.， 2009;Fan et al.， 2016;Liang & He，2018）。参与花青素合成途径的基因可分为结构基因和调控基因两类。结构基因包括早期生物合成基因（如CHS、CHI和F3H）和晚期生物合成基因（如DFR、ANS和UF3GT）（Tanaka et al.， 2008;Zhang & Schrader，2017）。目前研究发现参与花青素合成的调控基因主要编码MYB、bHLH和WD40家族蛋白（Deng & Lu，
2017;Ma & Constabel，2019）。PAP1为R2R3 MYB家族成员MYB75，它与同源蛋白PAP2/MYB90协调正调节花青素合成相关基因的表达，如PAL、CHS 和 DFR 等（Maier et al.， 2013;Shin et al.， 2015）。此外，Gonzalez et al.（2008）證明了MYB113或MYB114的过表达也导致拟南芥花素的显著增加。TT8、GL3和EGL3蛋白属于bHLH家族的转录因子，均与玉米的R转录因子同源，正调控拟南芥花青素的生物合成（Baudry et al.， 2004;Escaray et al.， 2017）。TTG1属于WD40蛋白家族成员的PAC1进化枝，
Koornneef（1981）报道能控制种皮颜、花青素积累、种子粘液和根毛发育等。MYB、bHLH和WD40调控因子通常形成三元MBW复合物发挥调节作用，直接调控花青素合成基因的表达，如DFR、BAN、LDOX、TT12、TT19和AHA10（Xu et al.， 2014）。深入研究花青素生物合成途徑及调控信号有助于人们理解植物的相关生理机制，对改良植物生长状况，提高作物经济效益具有潜在应用意义。
近年来，植物激素调控花青素的生物合成得到广泛关注。例如，通过施加外源激素可通过激活或抑制花青素合成相关基因的表达来控制水果中花青素的积累（Shen et al.， 2014;Chen et al.， 2016）。ABA激素是植物体内重要的生长调节物质之一，它广泛参与
调控植物的各种生理过程，如胚胎发育、种子休眠与萌发、幼苗生长、根系发育、果实成熟、叶片衰老，以及对干旱、高盐、高渗透压和低温等逆境胁迫的应答反应（Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki，2013;Dejonghe et al.， 2018;Brunetti et al.， 2019）。ABA信号途径关键转录因子ABI5属于bZIP家族成员，可被SnRK2激酶磷酸化，主要参与调控植物的种子萌发及萌发后生长等过程（Yu et al.， 2015;Pan et al.， 2018）。ABA激素能促进某些植物果实中花青素的合成和积累（Hiratsuka et al.， 2001;Jiang & Joyce， 2003;Shen et al.， 2014;An et al.， 2018）。但是，目前关于ABA调控拟南芥花青素合成的生物学功能及分子机制仍不清楚。本研究以拟南芥为实验材料，通过遗传学和分子生物学相关的实验方法探究了ABA对拟南芥幼苗花青素的诱导作用以及其信号调控拟南芥幼苗花青素合成的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
所有突变体都是野生型拟南芥Columbia-0遗传背景，突变种子tt8、myb-RNAi 和 pap1-D由杨洪全教授提供。将野生型拟南芥种子与突变体种子tt8、myb-RNAi和 pap1-D，
先用20%的84消毒液漂白8 min进行表面灭菌，再播种在含有0.6%琼脂和1%蔗糖的1/2 MS培养基上（pH 5.8），在4 ℃春化24 h后置于22 ℃的长日照条件下生长（光照/黑暗为16 h/8 h）。所用ABA激素从Sigma-Aldrich公司购买，Taq DNA聚合酶购自Takara Biotechnology公司，其他常用试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 ABA处理
参考An et al.（2018）的方法，将拟南芥种子播种在添加不同浓度（0、0.25、0.5、0.75 μmol·L-1）ABA的1/2 MS琼脂培养基上，4 ℃春化24 h 后置于长日照条件下，并在22 ℃生长6～12 d，观测幼苗花青素积累情况并取样用电子显微镜拍照。每个样品用ABA处理分析的生物重复不少于3个，且每个实验重复不少于3次。
1.3 花青素含量的测定
将含有0.25 μmol·L-1 ABA的1/2 MS琼脂培养基上生长的7 d龄的幼苗，包括野生型植株Col，突变体植株pap1-D、myb-RNAi和 tt8 在电子天平取样称重W（g）后加入1 mL盐酸甲醇提取物（甲醇∶盐酸体积比为99∶1），在4 ℃条件下保持在暗处振荡24 h。13 000
r·min-1离心10 min，取浸出液分别在530、657 nm波长处测量吸光度（OD值），花素苷的相对含量用公式（A530-0.25×A657）·g-1 FW计算（Xie et al.， 2016）。实验至少重复3次。
山中避雨教案 1.4 RNA提取和RT-qPCR
采用Hu & Yu（2014）的方法所述，使用Trizol试剂（Invitrogen）从拟南芥幼苗中提取总RNA后逆转录成cDNA后进行定量实时PCR（RT-qPCR）。第一链cDNA使用具有oligo（dT）18引物的M-Mu LV逆转录酶（Fermentas，EU），在20 μL反应体积中由1.5 μg DNA酶处理的RNA合成。使用2×SYBR Green I master mix在Roche Light Cycler 480实时PCR仪上进行RT-qPCR（Hu & Yu， 2014）。拟南芥ACTIN2基因用作基因表达的内参基因。每个样品用于RT-qPCR分析的生物学重复至少3个，且对每个生物学重复分析至少有2个技术重复。用于检测转录物的基因特异性引物见表1。
1.5 酵母双杂交实验 （Y2H）
企业医生 ABI5的CDs全长为1 326 bp，编码442个氨基酸。为验证ABI5蛋白与花青素合成相关
蛋白的互作关系，将ABI5的全长序列克隆到pGBKT7构建质粒BD-ABI5，参考Chen et al.（2012）构建分段质粒：BD-ABI51-164、BD-ABI5165-220、BD-ABI5165-442、BD-ABI5221-349和BD-ABI5350-442。将花青素合成相关促进因子的编码序列克隆到载体pGADT7中构得质粒AD-MYB75、AD-MYB90、AD-MYB113、AD-MYB114、AD-TT8和AD-TTG1。参考Xie et al.（2016）的方法，分别将其分段为N端和C端：MYB75的第1～122个氨基酸为N端，第123～249个氨基酸为C端，构建分段质粒AD-MYB75-N和AD-MYB75-C;MYB113的第1～123个氨基酸为N端，第124～247个氨基酸为C端，构建分段质粒AD-MYB113-N和AD-MYB113-C;TT8的第1～358个氨基酸为N端，第359～519个氨基酸为C端，构建分段质粒AD-TT8-N和AD-TT8-C;TTG1的第1～174个氨基酸为N端，第175～342个氨基酸为C端，构建分段质粒AD-TTG1-N和AD-TTG1-C。将融合于不同载体的质粒进行酵母双杂交实验。用于构建各种克隆的引物见表2。
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