第37卷第2期 森林工程Vol.37No.2 2021 年 3 月FOREST ENGINEERING Mar. ,2021
李唯一1，于凯悦1，刘宇航1，董爱荣“，刘君旭2
(1.东北林业大学林学院，哈尔滨150040;2.青岛市白蚁防治研究所，山东青岛266012)
摘要：为探究黏质■沙雷氏菌（Serratia marcescem)降解味峻乙烟酸有关的酶，用被酿■蓝比法、3. 5 -二硝基水杨酸 (D N S)比法、高锰酸钾滴定法和邻苯三酚比法分别检测黏质沙雷氏菌培养液中脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和 纤维素酶的酶活性，以不加咪唑乙烟酸的纯培养液作为对照。结果表明：以咪唑乙烟酸为唯一碳源培养的黏质沙雷氏菌，脲 酶活性培养初期时最高，然后逐渐下降，最后趋于平衡；蔗糖酶活性随培养时间缓慢上升；过氧化氢酶活性呈上升一下降一上 升一下降的趋势；多酚氧化酶活性培养相期时活性最高，后一直呈下降趋势,72 h后急剧下降至最低水平；纤维素酶活性先下 降后上升，培养结束时恢复至初期水平。通过相关性分析得知，咪唑乙烟酸降解率与脲酶活性呈高度负相关关系，与蔗糖酶 活性呈高度正相关关系。 关键词：咪唑乙烟酸；黏质沙雷氏菌；酶活性；降解率
中图分类号:S154.2;S481;S565.1文献标识码:A文章编号：1006 - 8023(2021)02 - 0018 - 05 Effect of Im
azethapyr on the Enzyme Activity of Serratia marcescens LI Weiyi1, YU Kaiyue1, LIU Yuhang1, DONG Airong1 * , LIU Junxu2
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；
2. Qingdao Institute of Termite Control, Qingdao 266012, China)
Abstract ： In order to explore the enzymes related to the degradation of imazethapyr by Serratia marcescens, the enzyme activities of urease, sucrase, catalase, polyphenol oxidase and cellulase in the culture medium of Serratia marcescens were detected by indophenol blue colorimetry, 3.5 - dinitrosalicylic acid (DNS) colorimetry, potassium permanganate titration and pyrogallol colorimetry, respectively. The pure culture medium without imazethapyr was used as control. The results showed that the urease activity of Serratia marcescens cultured with imazethapyr as the sole carbon source was the highest at the initial stage of culture, gradually decreased, and then tended to balance, and the sucrase activity increased slowly with the culture time. The activity of catalase showed a trend of increased -decreased - increased - decreased. The activity of polyphenol oxidase was the highest at the beginning of culture, and then decreased sharply to the lowest level after 72 hours. The cellulase activity decreased at first and then increased, and returned to the initial level at the end of culture. Th
rough correlation analysis, it was found that the degradation rate of imazethapyr was highly negatively correlated with urease activity, highly correlated with sucrase activity.
Kej^words：Imazethapyr；Serratia marcescens\enzyme activity；degradation rate
〇引言
咪唑乙烟酸是一种咪唑啉酮类除草剂，与其他常 用除草剂相比，具有杀草谱广、除草效果好、成本低、苗前苗后都可用、活性高和用量低等优点，在我国被
收稿日期=2020 - 09 - 30
基金项目：国家自然科学基金项目（31670494)
第一作者简介：李唯一，硕士研究生。研究方向为森林病理学。E-mail：****************
*通信作者：董爱荣，博士，副教授。研究方向为森林病理学。E-mail：**************
引文格式：李唯一，于凯悦，刘宇航，等.咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏 菌酶活性的影响[J].森林工程，2021，37(2) :18 -23.东菱克栓酶
LI W Y, YU K Y, LIU Y H, et al. Effect of imazethapyr on the enzyme activity of Serratia Marcescens[J^.Forest Engineering,2021,37(2)：18 -23.广泛使用[1]。例如，咪唑乙烟酸能有效提高苜蓿产 量、降低杂草种类[2-3]。目前黑龙江省主要使用于单 季大豆田[4\农药的大量使用会对生态环境造成破 坏，并且农药的残留也将危害人畜的健康[5]。
微生物是农药转化降解的重要因素之一。研 究表明，微生物主要是通过酶促反应对农药起作用[6]。黏质沙雷氏菌(■S e r r a t i a marcesceras)是一■种在自然界中广泛存在的兼性厌氧菌，是水和土壤的常 居菌，同时也是一种应用前景非常广阔的微生物[7]。例如，黏质沙雷氏菌能分泌高活性的几丁质 酶，具有杀菌杀虫作用，可用于防治植物病虫害[8]。黏质沙雷氏菌对亚洲柑橘木風（■D i a p/i o r i r e a c i t r i)若 虫有较高的杀虫活性，其发酵的上清液也可导致亚 洲柑橘木虱若虫死亡[9]。黏质沙雷氏菌产生的脂 肪酶可广泛应用于食品、制药以及生物能源等领
第2期李唯一，等：咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌酶活性的影响
19
唑乙烟酸降解率。采用Waters 2695液相谱仪与 WaterS 2996紫外检测器（上海力明生物科技有限公 司），流动相:V A 液为0• 05%冰乙酸乙腈，V B 液为 0.4%冰乙酸水溶液,V A 与V B 体积比为40: 60；分 离分析柱为 Agilent Z O R B A X Extend - C 18 柱（250 m m ，4. 6 m m ,5jxm )；进样条件：
柱温室温，进样量10 |xL ，检测波长254 n m 〇
咪唑乙烟酸降解率=[(CK 残留质量分数-加培
养液残留质量分数)/CK 残留质量分数]x 100%。
1.5数据分析
数据整理计算和作图采用
曹冲智救库吏
Excel 2010，相关性 分析采用SPSS 22_ 0统计分析软件(IBM 公司）。
2结果与分析
2.1咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌脲酶活性影响
对照组(CK
)为黏质沙雷氏菌的纯培养液，实验 组(N
)为加入咪唑乙烟酸的黏质沙雷氏菌培养液。 培养初期，实验组（N
)
脲酶活性远低于对照组
(
CK )，说明咪唑乙烟酸抑制了黏质沙雷氏菌分泌脲
酶。24 h 时，两组脲酶活性均降低，对照组（CK )脲 酶活性最低值达0.423 jju g /(min . mL )，之后两组脲
酶活性都逐渐趋于水平，差异性不大（图1)。
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
培养时间/h
C u l t u r e t i m e
图i
黏质沙雷氏菌培养液中脲酶活性的变化
Fig. 1 Change of urease activity in Serratia marcescens
2.2咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌蔗糖酶活性影响
对照组(C K )为黏质沙雷氏菌的纯培养液，实验 组(N )为加人咪唑乙烟酸的黏质沙雷氏菌培养液。 实验组（N )蔗糖酶活性呈缓慢上升的趋势，而对照 组(C K )蔗糖酶活性是先降低后升高。培养12 h 时，两组蔗糖酶活性基本相同。之后加入咪唑乙烟 酸的实验组（N )蔗糖酶活性开始缓慢上升，直到培 养结束。对照组（C K )蔗糖酶活性在培养24 h 时有 所下降，达到最低值807.23 ^#(1^11.呂），之后逐 渐上升并趋于平稳（图2)0
域[1°]。从黏质沙雷氏菌细胞壁提取的灵杆菌脂多 糖可以抗肿瘤[11]。黏质沙雷氏菌作为一种生防菌， 对连作土壤具有修复作用[12]。此外，黏质沙雷氏菌
还可以降解油脂[13]。
自然条件下，咪唑乙烟酸的降解不是以单一的方 式进行，它可以在多种不同酶作用下以不同的方式进 行[14]。酶具有专一性，而能降解同一类底物的酶通 常具有相似的性质。脲酶是一种催化尿素水解成氨 和二氧化碳的酶。蔗糖酶不仅能催化蔗糖水解生成 葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和 果糖。过氧化氢酶能催舰氧化氢鑛成氧和水。多 酸氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，能催化邻苯二酿 氧化成邻苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。 纤维素酶能在分解纤维素时起生物催化作用，是可以 将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。本文通过测定 咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌生
化酶活性的影响，探寻 与降解咪唑乙烟酸相关酶系，为咪唑乙烟酸及其他咪 唑啉酮类除草剂的生物酶酶W
理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
黏质沙雷氏菌（Serr ofia marcescms )为课题组前 期驯化得到的高效降解菌株。菌株富集培养采用牛 肉膏蛋白胨培养基。其他实验采用无机盐培养基。 1.2试验方法
将黏质沙雷氏菌接种于盛有100 m L 的富集培 养基的锥形瓶中，置于28 T 、160 r/min 的摇床上培 养2 d 。取10 m L 培养液加人盛有90 m L 质量分数 为100 mg /kg 的咪唑乙烟酸的无机盐培养基中，其 中咪唑乙烟酸为唯一碳源，对照组为加10 m L 的无 机盐培养基，均置于25 T J G O r /m i n 的摇床上培养 4 d ，从中取 12、24、48、72、96 h 的菌液，12 000 r/min 离心10 min ，取上清液即为粗酶液，测定各培养时间 的酶活性和降解率。1.3酶活性测定
脲酶活性测定采用靛酚蓝比法[15]。蔗糖酶 活性测定采用3,5 -二硝基水杨酸（D N S )比 法[16]。过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定 法[17]。多酚氧化酶活性测定采用邻苯三酚比 法[18]。纤维
素酶活性测定采用3,5-二硝基水杨 酸(D N S )比法[19]。1.4降解率的测定
参照靳颖华[2〇]的方法，采用液相谱法测定咪
+对照组(CK)
Control group
—实验寧
Experimental group
6
5
4
3 2
1
x
.-s .s :K y e
V
S B C D J P G —T n
•,_!!1
键
®
20森林工程第37卷
培养时间/h
Culture time
图3
黏质沙雷氏菌培养液中过氧化氢酶活性的变化
Fig. 3 Change of catalase activity in Serratia marcescens
2.4咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌多酚氧化酶活性 影响
对照组(C K )为黏质沙雷氏菌的纯培养液，实验 组(N )为加人咪哇乙烟酸的黏质沙雷氏菌培养液。
1 200 r
1 000 800 600 400 200-对照组(CK)
Control group 实验_)
Experimental group
在培养期间，两组多酚氧化酶活性的变化趋势大致 相同。培养12 h 时，两组多酚氧化酶活性相差不 多。培养24 h
时，两组多酚氧化酶活性均开始下 降，可能是因为咪唑乙烟酸抑制了黏质沙雷氏菌分 泌多酚氧化酶，但实验组（N )比对照组（C K )高3. 6
U /mL 。之后48 h 和72 h 时的多酚氧化酶活性变化 不大，72 h 之后两组多酚氧化酶活性均急速下降，
直到培养结束（图4)。
12 24 36 48 60 72 84 96 108
培养时间/h Culture time
12 24 36 48 60 72 84 96 108
培养时间/h Culture time
图2黏质沙雷氏菌培养液中蔗糖酶活性的变化
Fig. 2 Change of sucrase activity in Serratia marcescens
2.3咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌过氧化氢酶活性 影响
对照组(C K )为黏质沙雷氏菌的纯培养液，实验 组(N )为加入咪唑乙烟酸的黏质沙雷氏菌培养液。 加入咪唑乙烟酸的实验组(N )和未加咪唑乙烟酸的 对照组（C K )过氧化氢酶活性的变化趋势大致相同, 呈上升一下降一上升一下降的趋势。培养12 h 时， 两组过氧化氢酶活性最低。培养24 h 时，两组过氧 化氢酶活性均升高，而对照组（C K )的过氧化氢酶活 性髙于实验组(N )。这可能是因为黏质沙雷氏菌的 数量增加，活性增强，促进了过氧化氢酶的分泌。培 养48 h 时，实验组(N )过氧化氢酶活性有所下降，对 照组(C K )过氧化氢酶活性显著降低。培养72 h 时， 两组过氧化氢酶活性又开始上升，均恢复至24 h 时 的水平。之后又开始下降，直到培养结束(图3)。
图5
黏质沙雷氏菌培养液中纤维素酶活性的变化
Fig. 5 Change of cellulase activity in Serratia marcescens
12 24 36 48 60 72 84 96 108
培养时间/h Culture time
图4黏质沙雷氏菌培养液中多酣氧化酶活性的变化
Fig. 4 Change of polyphenol oxidase activity in Serratia marcescens
2.5 咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌纤维素酶活性
影响
对照组(C K )为黏质沙雷氏菌的纯培养液，实验 组(N )为加入咪唑乙烟酸的黏质沙雷氏菌培养液。 在培养初期，两组纤维素酶活性的变化趋势相同, 纤维素酶活性均有所升高。从24 h 开始，加人咪唑 乙烟酸的实验组（N )与不加咪唑乙烟酸的对照组 (C K )的变化趋势在各个时期均相反。培养48 h 时，对照组（C K )纤维素酶活性达到最髙值47. 91 (xg/(min • m L )，而实验组（N )纤维素酶活性显著降 低，达到最低值8. 74 j x g /( min • m L )。培养72 h 时，对照组（C K )纤维素酶活性为最低值36. 73 pg / (min • m L )，而实验组(N )则显著升高（图5)。
10
987654321 o
x l y A P o B
9S
B 3
A C J (
I —l i ,l o s
s
f e s
M 蠢安全心理学论文
K
('w )i 1:J
證
饮食与健康杂志a 震
o o o o o o
o
6 5 4 3 2 1x .-a
A J P
B 9S B I n =l
93
(Z J
s
.
,_u 1
S T i )籠ft fc f
5
5 0 5
2
2 1
1
x .l s A l p e c u
S B P I X O
J O U J d /c f o
P
H
第2期李唯一，等：咪唑乙烟酸对黏质沙雷氏菌酶活性的影响21黏质沙雷氏菌各酶活性各时间点对照组和实 验组显著性差异分析情况见表1。
表1黏质沙雷氏菌各时间点对照组和实验组显著性差异分析
Tab. 1 Analysis of significant difference between control group and experimental group at different time points of Serratia marcescem
T检验时间/h脲酶蔗糖酶过氧化氢酶多酚氧化酶纤维素酶T test Time Urease Sucrase Catalase Polyphenol oxidase Cellulase 列文方差相等性检验
Levene variance equality test
120.8870.4320.6680.4780.773
显著性（双尾）
Significant (double tail)北豆根提取物
0.004*0.9810.8110.8980.052
列文方差相等性检验
Levene variance equality test
240.3730.7380.5780.6130.994
显著性（双尾）
Significant (double tail)
0.1270.1840.045*0.0840.518
列文方差相等性检验
Levene variance equality test
480.8930.6630.6690.8850.293
显著性（双尾）
Significant (double tail)
0.7320.8540.009*0.6230.001*
列文方差相等性检验
Levene variance equality test
720.4450.1280.9290.9380.828
显著性(双尾）
Significant (double tail)
0.6640.6820.2950.3790.035*
列文方差相等性检验
Levene variance equality test
960.9050.3100.3430.3070.973
显著性(双尾）0.7500.7200.0480.014*0.084 Significant (double tail)
注：* .在0.05水平(双尾），相关性显著。
Note：* • At 0.05 level (double tail) , the correlation was significant.
2.6黏质沙雷氏菌对咪唑乙烟酸的降解率
黏质沙雷氏菌对咪唑乙烟酸的降解率趋势如 图6所示，在96 h内，随着时间的增长，咪唑乙烟酸 的降解率逐渐增加,48 h后达到86.45%，之后缓慢 增长，直至92.33%。
培养时间/h
Culture time
图6黏质沙雷氏菌对咪唑乙烟酸的降解率
Fig. 6 Degradation rate of ima^ethapyr by Serratia marcescem 2.7黏质沙雷氏菌液中各酶活性与降解率相关性分析
通过SPS S软件对不同培养时期的黏质沙雷氏 菌的各种酶活性数据与对应时期的咪哇乙烟酸降 解率进行相关性分析，结果见表2。以咪唑乙烟酸 为唯一碳源培养黏质沙雷氏菌，咪唑乙烟酸的降解 率与脲酶活性呈高度负相关；与蔗糖酶活性呈高度 正相关，与过氧化氢酶、多酚氧化酶和纤维素酶活 性相关性不显著。
3结论与讨论
利用本身对农药有降解作用的酶系基因，微 生物会将农药直接作为唯一碳源和能源，分解成诸 多分子量小的化合物[21]。以咪唑乙烟酸为唯一碳 源培养黏质沙雷氏菌，所选择的5种酶活性均有变 化，说明咪唑乙烟酸的降解跟这5种酶均有一定的 关系。脲酶活性在培养初期最高,24 h
急剧下降，
22森林工程第37卷表2黏质沙雷氏菌各酶活性与咪唑乙烟酸降解率相关性分析
Tab. 2 Analysis of the correlation between the enzyme activity of Serratia marcescens and the degradation rate of imazethapyr
相关性酶脲酶蔗糖酶过氧化氢酶多酚氧化酶纤维素酶降解率Correlation Enzyme Urease Sucrase Catalase Polyphenol oxidase Cellulase Degradation rate
Pearson相关性 Pearson correlation
脲酶
Urease
1.000
显著性(双尾）Significant ( double tail)
Pearson相关性 Pearson correlation 蔗糖酶
Sucrase
-0.722 1.000
显著性(双尾）
Significant (double tail)
0.126/
Pearson相关性 Pearson correlation 过氧化氢酶
Catalase
-0.7570.534 1.000
显著性(双尾）
Significant (double tail)
0.1380.354/
Pearson相关性 Pearson correlation
多酚氧化酶
Polyphenol oxidase
0.653-0.717-0.098 1.000
显著性(双尾）
Significant (double tail)
0.2330.1720.875/
Pearson相关性 Pearson correlation 纤维素酶
Cellulase
0.4500.211-0.364-0.052 1.000
显著性(双尾）
安全检查表法Significant ( double tail)
0.4470.7330.5470.933/
Pearson相关性 Pearson correlation
降解率
Degradation rate
-0.9360.9120.581-0.764-0.198 1.000
显著性(双尾）
Significant ( double tail)0.019*0.031*
0.3040.1320.749/
注：*.在0.05 7JC平(双尾），相关性显著。
Note：* •At 0.05 level (double tail), the correlation was significant.
然后趋于平衡；蔗糖酶活性呈缓慢上升；过氧化氢 酶活性呈上升一下降一上升一下降的趋势；多酚氧 化酶活性培养初期时活性最髙，后一直呈下降趋势，直至下降至最低水平；纤维素酶活性先下降后 上升，培养结束时恢复至初期水平，变化趋势与对 照组相反。
目前研究发现，能够降解咪唑啉酮类除草剂的 微生物主要为土壤中的细菌，包括酸单胞杆菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属、海球菌属、节细菌属、丙酸 杆菌属和无杆菌等，还有黑曲霉和放线菌[22]。本 文通过对黏质沙雷氏菌各酶活性与降解率之间的 相关性分析，发现咪唑乙烟酸的降解率与脲酶活性 呈高度负相关，与蔗糖酶活性呈高度正相关，与过氧化氢酶、多酚氧化酶和纤维素酶活性相关性不显 著，这与李德斌[23]的研究结果一致。同时进一步说 明了脲酶和蔗糖酶在咪唑乙烟酸的降解中起到了 较大的作用，为后续黏质沙雷氏菌降解农药除草剂 提供了理论基础。
【参考文献】
[1 ]吴昊.咪哩乙烟酸对土壤微生物落的影响及其降解的手性差
异研究[D].杭州：浙江大学,2019.
WU H. The effects of imazethapyr on soil microbial community structure, and the chiral differences of degradation in soils [ D ].
Hangzhou：Zhejiang University, 2019.
[2]刘刚.咪唑乙烟酸和高效氟吡甲禾灵为黄河三角洲地区紫花苜
蓿田较为理想的除草剂品种[J].农药市场信息,2017, 32
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议