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【关键词】肉苁蓉；1甲基4苯基 吡啶离子；帕金森病；生存率 帕金森病(Parkinson ' sdisease,PD )是中枢神经系统进行性变性疾 病。一旦出现临床症状，其黑质纹状体系统多巴胺神经元已经减少了 60%-80%尽管神经科学家采取包括左旋多巴制剂在内的各种方
法，但目前所有的研究都提示无法阻止其进展。 生长抑制和DNA损伤
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(growtharrest androAdamage inducedgenelSS, GADDI53 )是调控 细胞凋亡的一种重要蛋白，在细胞内质网应激等应激状态下大量表达
并转位于细胞核［1］。本研究观察了肉苁蓉提取物对 1甲基4 苯基 吡啶离子(1 methyl 4 phenylpyTidiniumicm, MPP+)介导
的SH SY5Y多巴胺能细胞系损伤的保护作用及对 GADD15表达的影
响，并探讨了其对帕金森病的神经保护作用。1材料与方法1.1材料 肉苁蓉提取物，上海市东方科技公司产品，PBS稀释成10mg/ml,22a m
滤膜过滤灭菌；MPP+ Sigma公司产品，无菌蒸馏水稀释成4mol/L ;
胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基
(Dulbecco'''' smodifiedeagle ' ''' smediumQMEM 胰蛋 白酶，均为Gibco公司产品；GADD15小鼠抗人单克隆抗体，SantaCruz 公司产品；小鼠抗人P actiri单克隆抗体，Sigma公司产品；甲基
噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT ),荷兰 Duchefa 公
反 转 录 试 剂 盒
(reversetranscri ptase p o i yme r as ec-ha inreact ion, RT PCR ),
MBi公司产品；SH SY5Y细胞，复旦大学神经生物学国家重点实验室
黄芳老师惠赠。1.2实验方法1.2.1细胞培养及分组SH SY5Y细胞
每2〜3d用10%DME培养液换液1次。待细胞增长至80%融合时，用
0.25%胰酶消化细胞，按1X 105分瓶传代，置于5%CO2勺细胞培养箱
中。实验用细胞分为对照组、MPP组和肉苁蓉提取物不同浓度组。用 DME培养液将MPP按1 : 10梯度稀释成400mmol/L,按1 : 100体积
比例加入96孔板或6孔板中，使MPP终浓度分别为0.25、0.5、1、
2和4mmol/L。肉苁蓉提取物用 DMEM培养液按1 : 10梯度稀释成 1mg/ml与10卩g/ml两个工作浓度。按1 : 100加入96孔板或6孔板
中，使终浓度分别为1、10和100卩g/ml。6孔板每孔总体积为2ml,
96孔板每孔总体积为200卩l。每项相同实验均重复3次。1.2.2MTT
检测细胞活性1.2.2.1MPP+对5H SY5Y细胞存活率的影响1X 104密
度5H SY5Y细胞200卩l接种于96孔板，24h后换含MPP终浓度分
别为0.25、0.5、1、2和4mmol/L的培养液，每浓度3复孔，置于
5%CO培养箱37C孵育，分别于6、12、24和48h时各孔加入MTT2011 , 继续孵育 4h取出培养板。吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜
(dimethylsulphoxideQMSO ) 150l 充分震荡 10min,待蓝颗粒
完全溶解后用全自动酶标仪（Biorad产品）570nm处测定吸光度值。
1.2.2.2肉苁蓉提取物对MPP介导的5H SY5Y细胞损伤的影响终浓
度1mmol/LMPP与肉苁蓉提取物分别为厦门槟榔小学1、10和100卩g/ml同时加入
96孔板置5%CO2培养箱37C孵育48h。其余步骤同 1.2.2.1。
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b 2. 3RT卩CR检测GADD153勺mRNA表达终浓度1mmol/LMPP与肉苁
蓉提取物分别为1、10和100卩g/ml，同时加入6孔板置5%CO培养 箱37C孵育48h。取出6和平县教育局孔培养板，PBS冲洗，按Trizol法提取总
RNA取1卩gRNA按反转录试剂盒说明进行逆转录。聚合酶链反应
总体积为25卩1。引物序列为：GADD153上游引物，5
GC；-\CCTCC：CAGA&CCCTCACTCTCC 3 ' ；下游引物，5
GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG 3' 3 min 上游引物，5'
ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC 3 ' ；下游引物
TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGGC 3'扩增目的产物的长度分别为422bp
和244bP。94C预变性5min。循环参数为：95C变性0.5min , 60C
退火0.5min , 72C延伸1min,共35个循环。取PCR产物4卩l，电
泳后拍照。互教通124Westemblotting 检测 GADD153蛋白表达终浓度 1mmol/LMPP与肉苁蓉
提取物分别为1、10和100卩g/ml ,同时加入6 孔板置5%CO培养箱37C孵育48h。取出6孔培养板，PBS冲洗，加 入60卩l蛋白裂解液裂解，超声震荡，100C变性10min。用Lowry 法测定样品蛋白浓度。电泳：积层胶 60V30min,分离胶120V90min;
PVDF膜转膜110V100min加1 年金基金: 50小鼠抗人GADD15单克隆抗体，4C
过夜。TBST溶液洗涤3次，10min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室 温孵育2h,化学发光法显影X胶片。胶片用Alphalmage950自动扫 胶系统得到条带灰度值。每个样本的免疫印迹条带均与同一样本的
3 actin比较后作统计学分析。1.3统计学方法采用SPSS11.5软件
纪实摄影论文
对SH SY5Y细胞存活率的影响不同浓度MPP作用SH SY5Y细胞后,
细胞存活率随MPP的浓度增加而降低；MPP +1mmo 1/1浓度状态下细胞
存活率随时间增长而降低。呈现明显的量效与时效关系。见图 1丢勒。其
中MPP +1mmol/组在48h存活率为（45.30 士 3.21）% 低于50% 故
选用1mmol/L MPP作为制作帕金森病细胞模型的处理剂量。图 1不同
浓度 MPP+对 SH SY5Y 存活率的影响（略）
FigurelEffectsofdiffere ntc oncen trati on sof MPP+on cellviabilit yofSH SY5Y2. 2：肉苁蓉提取物对1mmol/LMPP介导的SH SY5Y细胞
存活率的影响肉苁蓉提取物对 MPP介导的损伤有明显的保护作用。
保护作用随浓度增加而加强。MPP +1mmol/处理的细胞48h存活率为
（45.30 士 3.21 ） %, 1卩g/ml肉苁蓉提取物处理的细胞存活率为
(85.97 士 3.41 ) % 10 a g/ml 为(129.97 士 4.84 ) % 100 卩 g/ml 为
（164.10 士 3.91 ） %三种浓度与 MPP +1mmol/l对照处理比较，细胞
存活率差异有统计学意义（PV 0.01 ）。提示肉苁蓉提取物不仅有较好 的神经保护作用，而且还可能有促进细胞增殖的作用。见图 肉苁蓉提取物对 MPP介导的帕金森病细胞模型 GADD153mRNA达的
影响MPP +1mmol/处理SH SY5Y细胞后，在胶上观察到GADD153mRNA
水平明显较对照组明亮，统计出的结果也表明两者之间差异有统计学 意义（PV 0.01 ）。肉苁蓉提取物组与 MPP+1mmol/L处理组相比,
GADD153mRN平不仅在胶上显示出其随着肉苁蓉提取物浓度的增加
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